【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原菌检测，具体涉及一种基于限制性核酸内切酶编码和多重滚环扩增对布鲁氏菌病病原鉴别的试剂盒。
技术介绍
1、布鲁氏菌病(brucellosis)，又称为地中海热、马耳他热，简称布病，是由布鲁氏菌属(brucella)的细菌所引起的一种人畜共患传染病。布病一般家畜均易感，如牛、羊、猪、犬等，临床表现为雌性家畜流产或不育；雄性家畜出现睾丸炎等症状。流行病学调查结果显示，我国布病流行种型以牛种、羊种、猪种布鲁氏菌居多，引起的布病疫情比例高达93.21％。由此可见，建立牛种、羊种、猪种布鲁氏菌快速简便的检测鉴定方法，对布病防控及净化具有重要意义。
2、布鲁氏菌病的诊断和检测方法一直是该病防控的重要部分，主要有病原学、血清学和分子生物学检测三大方面。病原学的分离培养虽然是布鲁氏菌检测的“金标准”，但是，其耗时长，操作安全风险大，必须在bsl-3级实验室中由专业人员完成，并不适于普通机构常规开展。血清学方法是常用的检测手段之一，包括凝集试验(例如：虎红平板凝集试验rbt和试管凝集试验sat)和酶联免疫吸附试验(elisa)等。但其在种型区分中尚有困难，尤其是区分自然感染和人工免疫动物。此外，也存在操作步骤多、检测效率低等不足。
3、在分子生物学核酸检测
，测序和pcr及其衍生技术是目前最常用于病原鉴定的分子生物学方法，但上述分子生物学方法均需依赖昂贵的变温仪器设备，且耗时较长。
4、在对检测设备和技术更加便携和快速的需求下，具有更大发展空间的恒温扩增(isothermal amplif
5、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,re)是一类能够识别特定核酸序列，并在一定位点切割dna的核酸内切酶。尤其是type iip亚类的re，具有精准而稳定的识别和切割特性。re丰富的种类、众多的精准识别序列、多样化的切割位点和大规模的商业化开发使得这一丰富的分子识别信息资源可以用作分子编码信息库。rca的锁式探针在核酸检测中虽然具有自身突出的优势，但是一种探针检测一种样品的低通量、单通道模式依旧有待突破。因而，多重(multiplex)探针编码策略逐渐成为一种正在探索中，并颇具前景的解决方案。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术的目的是提供了一种基于限制性核酸内切酶编码和多重滚环扩增对布鲁氏菌病病原鉴别的试剂盒，本专利技术设计了三条限制性核酸内切酶编码的rca锁式探针，通过优化条件，在常温下利用滚环扩增技术对常见布鲁氏菌种(牛种、羊种和猪种)进行了检测，并对野生毒株(brucella.abortus 2308)和疫苗株(brucella.abortus a19)进行了鉴别，实现了多重、高通量的核酸检测，极大简化了操作过程。目前尚未见基于reco-rca筛检系统对布鲁氏菌进行检测的报道。因此该技术应用到家畜布鲁氏菌病检测中，是该技术在病原检测领域应用的一项重大突破。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供一种基于限制性核酸内切酶编码和多重滚环扩增(reco-rca)对布鲁氏菌病病原鉴别的试剂盒，所述的试剂盒包括包括扩增牛种布鲁氏菌特异性靶标targ n的引物探针组、扩增羊种布鲁氏菌特异性靶标targ y的引物探针组、扩增猪种布鲁氏菌特异性靶标targ z的引物探针组、扩增牛种布鲁氏菌野毒株2308特异性靶标targ 2308的引物探针组和扩增牛种布鲁氏菌疫苗株a19特异性靶标targa19的引物探针组以及对应的布鲁氏菌特异性靶标；
4、扩增牛种布鲁氏菌特异性靶标targ n的引物探针组包括re编码锁式探针prob n和滚环扩增引物pri ny，锁式探针prob n的核苷酸序列如seq id no.7所示，滚环扩增引物pri ny的序列如seq id no.10所示；
5、扩增羊种布鲁氏菌特异性靶标targ y的引物探针组包括re编码锁式探针prob y和滚环扩增引物pri ny，锁式探针prob y的核苷酸序列如seq id no.8所示，滚环扩增引物pri ny的序列如seq id no.10所示；
6、扩增猪种布鲁氏菌特异性靶标targ z的引物探针组包括re编码锁式探针prob z和滚环扩增引物pri z，锁式探针prob z的核苷酸序列如seq id no.9所示，滚环扩增引物pri z的序列如seq id no.11所示。
7、扩增牛种布鲁氏菌野毒株2308特异性靶标targ 2308的引物探针组包括re编码锁式探针prob 2308和滚环扩增引物pri ny，锁式探针prob 2308的核苷酸序列如seq idno.32所示，滚环扩增引物pri ny的序列如seq id no.10所示；
8、扩增牛种布鲁氏菌疫苗株a19特异性靶标targ a19的引物探针组包括re编码锁式探针prob a19和滚环扩增引物pri ny，锁式探针prob a19的核苷酸序列如seq id no.33所示，滚环扩增引物pri ny的序列如seq id no.10所示。
9、基于上述技术方案，进一步地，所述探针prob n、prob y、prob z、prob 2308、proba19的5′端均标记有磷酸基团。
10、基于上述技术方案，进一步地，所述的牛种布鲁氏菌特异性靶标targ n的核苷酸序列如seq id no.1所示，羊种布鲁氏菌特异性靶标targ y的核苷酸序列如seq id no.3所示，猪种布鲁氏菌特异性靶标targ z的核苷酸序列如seq id no.5所示，牛种布鲁氏菌野毒株2308特异性靶标targ 2308的核苷酸序列如seq id no.28所示，牛种布鲁氏菌疫苗株a19特异性靶标targ a19的核苷酸序列如seq id no.30所示。
11、基于上述技术方案，进一步地，所述的试剂盒中包括获得牛种、羊种和猪种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌疫苗株a19和野毒株2308的特异性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于限制性核酸内切酶编码和多重滚环扩增对布鲁氏菌病病原鉴别的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括扩增牛种布鲁氏菌特异性靶标Targ N的引物探针组、扩增羊种布鲁氏菌特异性靶标Targ Y的引物探针组、扩增猪种布鲁氏菌特异性靶标Targ Z的引物探针组、扩增牛种布鲁氏菌野毒株2308特异性靶标Targ 2308的引物探针组和扩增牛种布鲁氏菌疫苗株A19特异性靶标TargA19的引物探针组以及对应的布鲁氏菌特异性靶标；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针Prob N、Prob Y、Prob Z、Prob2308、Prob A19的5′端均标记有磷酸基团。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的牛种布鲁氏菌特异性靶标Targ N的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，羊种布鲁氏菌特异性靶标Targ Y的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，猪种布鲁氏菌特异性靶标Targ Z的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，牛种布鲁氏菌野毒株2308特异性靶标Targ 2308的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，牛种布鲁氏菌
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括获得牛种、羊种和猪种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌疫苗株A19和野毒株2308的特异性靶标所需的不对称PCR的上游引物、下游引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，牛种布鲁氏菌不对称PCR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；羊种布鲁氏菌不对称PCR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.15所示；猪种布鲁氏菌不对称PCR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；牛种布鲁氏菌野毒株2308和疫苗株A19不对称PCR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括T4 DNA ligase、Exonuclease I、Exonuclease III、EcoR I、Hind III、Xho I、phi29 DNA聚合酶、T4 DNAligase buffer、phi29 DNA polymerase buffer、dNTPs、无菌水和SYBR Green II。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的RE编码锁式探针的浓度为1μM以上，布鲁氏菌特异性靶标浓度为1-10μM，T4 DNA ligase的浓度为200～500U/L。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的Exonuclease I和Exonuclease III的加入量为0.1-1μL，浓度为5-200U/μL；步骤(3)中所述的限制性核酸内切酶(EcoR I、Hind III和Xho I)的加入量为0.5-5μL，浓度为5-200U/μL。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的滚环扩增引物与RE编码锁式探针的浓度比≥1，phi29 DNA聚合酶≥2.5U。
...【技术特征摘要】
1.一种基于限制性核酸内切酶编码和多重滚环扩增对布鲁氏菌病病原鉴别的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括扩增牛种布鲁氏菌特异性靶标targ n的引物探针组、扩增羊种布鲁氏菌特异性靶标targ y的引物探针组、扩增猪种布鲁氏菌特异性靶标targ z的引物探针组、扩增牛种布鲁氏菌野毒株2308特异性靶标targ 2308的引物探针组和扩增牛种布鲁氏菌疫苗株a19特异性靶标targa19的引物探针组以及对应的布鲁氏菌特异性靶标；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针prob n、prob y、prob z、prob2308、prob a19的5′端均标记有磷酸基团。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的牛种布鲁氏菌特异性靶标targ n的核苷酸序列如seq id no.1所示，羊种布鲁氏菌特异性靶标targ y的核苷酸序列如seqid no.3所示，猪种布鲁氏菌特异性靶标targ z的核苷酸序列如seq id no.5所示，牛种布鲁氏菌野毒株2308特异性靶标targ 2308的核苷酸序列如seq id no.28所示，牛种布鲁氏菌疫苗株a19特异性靶标targ a19的核苷酸序列如seq id no.30所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括获得牛种、羊种和猪种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌疫苗株a19和野毒株2308的特异性靶标所需的不对称pcr的上游引物、下游引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，牛种布鲁氏菌不对称pcr上游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示；羊种布鲁氏菌不对称pcr上游引物的核苷酸序列如seq...
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