【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种猪卵母细胞的体外成熟培养基及体外成熟培养方法。
技术介绍
1、哺乳动物卵母细胞为胚胎发育提供了大部分的母体遗传物质如细胞质成分、细胞器和细胞膜。卵母细胞必须经历染色体分裂和细胞质分裂才能达到成熟。卵母细胞的成熟过程是决定受精成功、受精卵的形成和胚胎正常发育的先决必要性生理事件。随着体外受精、核移植和转基因动物生产技术的应用和发展，对成熟卵母细胞的需求量越来越大。由于体内成熟卵母细胞数量较少且取用途径受限。因此，体外培养成熟卵母细胞技术得到了迅速发展。然而，体外培养成熟卵母细胞的质量和随后胚胎的发育能力远不如体内成熟的卵母细胞。猪卵母细胞体外培养基可能缺乏某些必需的营养成分、生长因子或激素，导致其成熟率通常低于80%。因此，迫切需要优化猪卵母细胞体外培养基的配方。
2、猪卵泡液（porcine follicular fluid，pff）是卵泡内的液体，它为卵母细胞的成熟和发育提供了必要的营养和环境，具体表现是：（1）提供营养供给：卵泡液中含有多种营养成分，如氨基酸、维生素、矿物质和代谢中间产物，这些成分可以直接为卵母细胞提供营养；（2）促进卵母细胞成熟：卵泡液中含有的激素（如雌二醇、孕酮、促性腺激素等）和生长因子对卵母细胞的成熟至关重要；（3）扮演细胞间通讯：卵泡液中的细胞因子和信号分子可以模拟卵母细胞与颗粒细胞之间的通讯，这对于卵母细胞的成熟和后续的胚胎发育非常重要；（4）调节 ph 和渗透压：卵泡液可以帮助调节培养基的 ph 和渗透压，使其更接近体内环境，有利于卵母细胞的生存和功能；
3、然而，卵泡液在猪卵母细胞体外培养中的使用存在众多问题：（1）批次间差异：不同季节和不同个体的卵泡液成分存在差异，导致培养的卵母细胞结果重复性差实验结果不稳定；（2）污染风险：卵泡液中含有细菌、病毒或其他有害物质，需要经过严格处理才能用于卵母细胞的体外培养；（3）成分复杂：卵泡液的成分非常复杂，其中一些成分的具体作用机制尚不明确，这给培养基的标准化带来了挑战。同时，血清在卵母细胞培养基中也会因为批次间差异、病毒和细菌污染、伦理和成本问题和成分不明确等问题限制培养基标准化的生产。
4、因此，为克服现有培养基存在的上述问题，迫切需要研发一种高效、标准化配制的新型卵母细胞体外成熟培养基，为猪卵母细胞提供更加稳定和可控的、利于提高成熟率的体外培养环境。
5、因此，现有技术有待进一步改进。
技术实现思路
1、针对现有猪卵母细胞体外成熟培养技术存在的卵母细胞成熟率低、质量差和实验重复不稳定等问题，本专利技术的提供了一种猪卵母细胞的体外成熟培养基及体外成熟培养方法，该体外成熟培养基成分稳定和可控，显著提高卵母细胞成熟率，是一种高效、标准化配制的新型卵母细胞体外成熟培养基。
2、为解决上述问题，本申请提供以下的技术方案：
3、第一方面，本申请提供一种猪卵母细胞的体外成熟培养基，其包括以下成分：
4、成纤维细胞生长因子、葡萄糖、半胱氨酸、丙酮酸钠、表皮生长因子、聚乙烯醇、孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素、促卵泡素、重组猪白介素-6、角质细胞生长因子，余量为 tcm199 培养基。
5、可选地，所述猪卵母细胞的体外成熟培养基还包括：双抗。所述双抗为青霉素和链霉素。
6、实验发现，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，fgf）、重组猪白介素-6（porcine interleukin-6，il-6）和角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，kgf-2）这三种成分协同配合具有促进猪皮肤干细胞分化的功能，在此基础上进一步发现，上述三种成分可有效替代现有配方中必不可少的卵泡液（pff）和血清，通过与上述培养基中的其他成分组成一种高效、标准化配制的新型卵母细胞体外成熟培养基。因此该培养基成分稳定和质量可控，有效避免由于卵泡液（pff）和血清导致的批次间差异、污染风险和难以标准化的问题。
7、可选地，所述猪卵母细胞的体外成熟培养基包括以下含量的各成分： 0.5~10ng/ml的成纤维细胞生长因子、1~10mm的葡萄糖、0.1~1mm的半胱氨酸、0.1~3mm的丙酮酸钠、1~10ng/ml的表皮生长因子、5~15%的聚乙烯醇、50~150 iu/ml的孕马血清促性腺激素、50~150iu/ml的人绒毛膜促性腺激素、200~300 iu/ml的促卵泡素、1~25ng/ml的重组猪白介素-6、0.5~5ng/ml的角质细胞生长因子和0.1~5%的双抗，余量为 tcm199 培养基。
8、优选地，所述猪卵母细胞的体外成熟培养基包括以下浓度的各成分：
9、0.5 ng/ml的成纤维细胞生长因子、3.05 mm的葡萄糖、0.57 mm的半胱氨酸、0.91mm的丙酮酸钠、2.5 ng/ml的表皮生长因子、10%的聚乙烯醇、100 iu/ml的孕马血清促性腺激素、100 iu/ml的人绒毛膜促性腺激素、250 iu/ml的促卵泡素和 1%的双抗，2.5 ng/ml的重组猪白介素-6 、2.5 ng/ml的角质细胞生长因子，余量为 tcm199 培养基。
10、实验证明，上述猪卵母细胞的体外成熟培养基的成熟率最高，方案最优化。该培养基培养的猪卵母细胞的成熟率最高，达到80%以上，且卵母细胞质量好，囊胚率高，且稳定性好，能在2-8℃存储一个月不失活。
11、第二方面，本申请还提供一种猪卵母细胞的体外成熟培养方法，该体外成熟培养方法为：将猪卵母细胞加入到前述的体外成熟培养基进行培养。
12、可选地，所述猪卵母细胞的体外成熟培养方法包括以下步骤：
13、s1、在孔板中加入前述的猪卵母细胞的体外成熟培养基，用矿物油密封，提前置于38.5℃、5%co2、完全饱和湿度培养箱中平衡2~4 h；
14、s2、猪卵母细胞-卵泡复合体（cumulus-oocyte complexes，cocs）的体外分离：抽取直径2-6 mm的新鲜卵泡的卵泡液至离心管，于37℃水浴锅中自然沉降10 min，弃上清后，用tl-hepes 操作液洗涤细胞沉淀，再温浴沉降10 min，重复至少3次，再在显微镜下挑选胞质均匀且含有3-5层颗粒细胞的猪卵母细胞-卵泡复合体（cocs）；
15、s3、猪卵母细胞-卵泡复合体的体外培养：用tl-hepes对上一步挑选出来的猪卵母细胞-卵泡复合体进行清洗，然后随机选择每组40-50个猪卵母细胞-卵泡复合体并将其转移至s1平衡后的孔板中，培养44 h至mii期，获得猪本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪卵母细胞的体外成熟培养基，其特征在于，包括以下成分：
2.根据权利要求1所述的猪卵母细胞的体外成熟培养基，其特征在于，还包括：双抗。
3.根据权利要求1所述的猪卵母细胞的体外成熟培养基，其特征在于，包括： 0.5~10ng/ml的成纤维细胞生长因子、1~10mM的葡萄糖、0.1~1mM的半胱氨酸、0.1~3mM的丙酮酸钠、1~10ng/mL的表皮生长因子、5~15%的聚乙烯醇、50~150 IU/mL的孕马血清促性腺激素、50~150 IU/mL的人绒毛膜促性腺激素、200~300 IU/mL的促卵泡素、1~25ng/ml的重组猪白介素-6、0.5~5ng/ml的角质细胞生长因子和0.1~5%的双抗，余量为 TCM199 培养基。
4.根据权利要求3所述的猪卵母细胞的体外成熟培养基，其特征在于，包括以下浓度的各成分：
5.一种猪卵母细胞的体外成熟培养方法，其特征在于，所述体外成熟培养方法为：将猪卵母细胞加入到如权利要求1~4中任一项所述的体外成熟培养基进行培养。
6.根据权利要求5所述的猪卵母细胞的体外成熟培养
7.根据权利要求5所述的猪卵母细胞的体外成熟培养方法，其特征在于，还包括：S4、卵母细胞的卵丘扩散率、成熟率、卵裂率和囊胚率的测定。
8.根据权利要求5所述的猪卵母细胞的体外成熟培养方法，其特征在于，所述步骤S4为：对培养成熟后44 h的卵母细胞在显微镜下拍照并统计卵丘扩散率；用 0.1%透明质酸酶消化成熟卵母细胞，挑选裸卵，在体视镜下观察并计数极体排出数量计算成熟率；通过对成熟卵母细胞孤雌激活后，统计卵裂率和囊胚率。
...【技术特征摘要】
1.一种猪卵母细胞的体外成熟培养基，其特征在于，包括以下成分：
2.根据权利要求1所述的猪卵母细胞的体外成熟培养基，其特征在于，还包括：双抗。
3.根据权利要求1所述的猪卵母细胞的体外成熟培养基，其特征在于，包括： 0.5~10ng/ml的成纤维细胞生长因子、1~10mm的葡萄糖、0.1~1mm的半胱氨酸、0.1~3mm的丙酮酸钠、1~10ng/ml的表皮生长因子、5~15%的聚乙烯醇、50~150 iu/ml的孕马血清促性腺激素、50~150 iu/ml的人绒毛膜促性腺激素、200~300 iu/ml的促卵泡素、1~25ng/ml的重组猪白介素-6、0.5~5ng/ml的角质细胞生长因子和0.1~5%的双抗，余量为 tcm199 培养基。
4.根据权利要求3所述的猪卵母细胞的体外成熟培养基，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓亚，张颖，李兰，沈伟，程顺峰，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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