【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，特别涉及一种提高球孢白僵菌合成 r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸产量的生物合成方法。
技术介绍
1、苯氧基丙酸类化合物是一类乙酰辅酶a羧化酶抑制剂，能够特异性地杀灭禾本科杂草。作为一类重要的除草剂，苯氧基丙酸类化合物的合成受到广泛关注。 r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸（ r-hppa）是合成芳氧苯氧基丙酸类除草剂的关键手性中间体，其生产制备尤为重要。生物催化法生产 r-hppa具有反应条件温和、环境友好、副产物少以及对映选择性羟化等优点，日益受到关注。
2、现有的 r-hppa合成技术中，已公开专利申请cn117821528.a、已公开专利申请cn117947109.a等分别提出了提高球孢白僵菌生物膜发酵前体物质 r-2-苯氧基丙酸（ r-ppa）产生 r-hppa的不同工艺路线。cn117821528.a使用了固定化载体增强生物膜稳定性，但发酵过程需要进行6次发酵环境迁移，每次迁移后都需要重新补料大量营养物质以维持底物转化效率。cn117947109.a的优化策略为选择吸收效率更高的碳源和氮源营养物，同时维持高底物浓度，抬高了工业生产原料的价格成本。因此开发一种低价且高效提高球孢白僵菌生物膜催化效率的工艺被认为是必要的。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种降低营养物质投料、底物转化率高、生产效率高的生物合成方法。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种提高球孢白僵菌 r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸产量的生物合成方法，包括以下步骤：
4、s1、分别活化球孢白僵菌与毕赤酵母，获得球孢白僵菌斜面单菌落与毕赤酵母斜面单菌落；
5、s2、将球孢白僵菌斜面单菌落接种至发酵培养基进行培养，得到球孢白僵菌种子液；
6、s3、将球孢白僵菌种子液接种至第一阶段发酵培养基进行第一阶段生物膜发酵培养；
7、s4、将毕赤酵母斜面单菌落接种至pdb培养基进行培养，得到毕赤酵母培养物；
8、s5、在第一阶段生物膜发酵培养过程中，添加毕赤酵母培养物至第一阶段生物膜发酵培养基，与球孢白僵菌共培养，反应转入第二阶段生物膜发酵培养；
9、s6、在第二阶段生物膜发酵培养过程中，添加碳源营养物和氮源营养物。
10、作为优选，s2中的发酵培养基与s3中的第一阶段发酵培养基包含： r-2-苯氧基丙酸40～60g/l、碳源30～50g/l、氮源5～15g/l、mgso40.9~1.1 g/l、cacl20.65～0.85g/l、k2hpo41.7～1.9g/l、kh2po40.65～0.85g/l、微量元素溶液40～60ml/l、水。
11、作为优选，s2中的发酵培养基与s3中的第一阶段发酵培养基中的微量元素溶液包含：edta-2na·2h2o 1~3 g/l，feso4·7h2o 0.4~0.8 g/l，znso4·7h2o 0.1~0.3 g/l，mnso4·h2o 0.1~0.3 g/l，nicl·6h2o 0.02~0.06 g/l，cocl20.01~0.03 g/l，h3bo30.02~0.04 g/l，na2moo4·h2o 0.003~0.007 g/l。
12、作为优选，球孢白僵菌种子液培养条件为：23~33℃、150~250rpm条件下振荡培养2～4天。
13、作为优选，第一阶段发酵培养基含有固定化载体。
14、作为优选，第一阶段发酵培养基所含固定化载体为聚氨酯海绵。
15、作为优选，第一阶段生物膜发酵培养条件为：23~33℃条件下静态培养7～15天。
16、作为优选，毕赤酵母培养物培养条件为：23~33℃、150~250rpm条件下振荡培养2～4天。
17、作为优选，毕赤酵母培养物的添加时间为第一阶段生物膜发酵培养过程的第3～7天。
18、进一步优选的，毕赤酵母培养物的添加时间为第一阶段生物膜发酵培养过程的第5天。
19、作为优选，毕赤酵母培养物的添加剂量为1%～10% 的体积接种量。
20、进一步优选的，毕赤酵母培养物的添加剂量为5% 的体积接种量。
21、作为优选，在第二阶段生物膜发酵培养过程的第1天时添加碳源和氮源营养物。
22、作为优选，碳源营养物为5%～15%（v/v）的500～700g/l葡萄糖溶液，氮源营养物为5%～15%（v/v）的100～300g/l酵母提取物溶液。
23、作为优选，碳源营养物为10%（v/v）的600g/l葡萄糖溶液，氮源营养物为5%（v/v）的200g/l酵母提取物溶液。
24、作为优选，所述球孢白僵菌的菌株为球孢白僵菌zjb23323（ beauveriabassianazjb23323），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m2023584，保藏日期：2023年04月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。该菌株为已知的菌株，是以 beauveriabassianazjb16001为出发菌株，经过自然选育、uv诱变、室温等离子（artp）诱变、亚硝基胍诱变等步骤获得，已在中国专利cn116590153a中公开。
25、本专利技术具有以下有益效果：
26、为增强球孢白僵菌的生物膜催化稳定性，专利技术人在使用固定化载体的同时还引入利用了微生物亚群的协同效应，通过微生物共培养使各菌株充分接触、增强细胞间交叉喂养，调控生物膜微环境并改善生物膜形成效果和污染耐受性；在此基础上，专利技术人筛选、排查大量与球孢白僵菌亲缘关系较远且互不拮抗的菌株，最终选定毕赤酵母作为微生物共培养的组成部分；实验证据显示，本专利技术显著提高了底物转化率与 r-hppa产量，兼顾了生产效率，11天可实现底物完全发酵；同时将营养物质补料次数控制在1次，亦降低营养物质消耗总量，减少了操作成本与原料成本。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种提高球孢白僵菌R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸产量的生物合成方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
7.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
8.根据权利要求1或权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于：
9.根据权利要求1或权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于：
10.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种提高球孢白僵菌r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸产量的生物合成方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，邹树平，陈晓敏，马逸之，胡忠策，岑宇科，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。