【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种分泌表达中性纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法。
技术介绍
1、中性纤维素酶一般指适应中性及略偏碱性环境的纤维素酶，其最适ph值通常在7.0左右，在ph值4.0-8.0的范围内也能有较好的活性。酸性纤维素酶适应ph值较低的酸性环境，最适ph值范围一般在4.5-5.5，在ph6.0以上下活力大大下降。中性纤维素酶和酸性纤维素酶在多个方面存在差异，具体如下：
2、(1)来源不同。中性纤维素酶：最常见且应用广泛，一般由细菌培养所产生，细菌产纤维素酶的产量相对较高，且所产生的酶大多分泌到培养液中，提取纯化相对容易。酸性纤维素酶：一般由真菌提取，真菌纤维素酶产量也较高。
3、(2)应用领域不同。中性纤维素酶：在纺织印染行业中应用广泛，能用于牛仔布的剥色、起花及纯棉织物的软化工艺等，可使织物获得持久的抗起毛起球性能，处理后的织物花点清晰、立体感强、返沾色低，且对织物强力损伤小；在食品行业中也有应用，比如在一些食品加工过程中用于改善食品的质地和口感。酸性纤维素酶：常用于饲料和生物炼制领域，如将生物质中的纤维素彻底水解成葡萄糖；在酿酒业中也有应用，比如提高原料的利用率。
4、(3)作用特点不同。中性纤维素酶：反应相对温和，对织物损伤小，对ph值的波动敏感性较小，工艺重现性好。酸性纤维素酶：对棉织物的处理效果相对较强，但处理不当可能导致织物强力下降、明显失重等问题，并且在处理过程中可能存在“返沾色”的情况，即靛蓝染料会再沉积于服装的白色部分。
5、里氏木霉(t
6、通常利用毕赤酵母表达获得中性纤维素酶，但是毕赤酵母不是食品安全菌株，不符合食品安全规范；而且需要甲醇诱导基因表达，甲醇有毒性和易燃易爆的危险性。里氏木霉是食品安全菌株，但自身表达的内源酸性纤维素酶太多，尤其是cbh1和cbh2。目前还未见用异源的中性纤维素酶基因代替里氏木霉内源的酸性纤维素酶cbh1和cbh2，以使得里氏木霉转变成生产中性纤维素酶的菌株的相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种分泌表达中性纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过将中性纤维素酶编码基因替换里氏木霉菌内源酸性纤维素酶基因cbh1和cbh2，成功构建了分泌表达中性纤维素酶的里氏木霉工程菌，该工程菌可用于中性纤维素酶的生产。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种分泌表达中性纤维素酶的里氏木霉工程菌，其是在里氏木霉菌中异源表达中性纤维素酶得到，所述异源表达中性纤维素酶包括将所述里氏木霉菌中内源酸性纤维素酶基因cbh1和cbh2依次替换为所述中性纤维素酶的编码基因的步骤。
4、优选的是，所述中性纤维素酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、优选的是，所述里氏木霉菌包括里氏木霉菌rut-c30。
6、本专利技术还提供一种所述的里氏木霉工程菌的构建方法，包括利用中性纤维素酶的编码基因依次替代里氏木霉菌中内源酸性纤维素酶基因cbh1和cbh2的步骤。
7、优选的是，所述依次替代的方法包括以下步骤：
8、将中性纤维素酶的编码基因分别与表达质粒i和表达质粒ii，构建重组质粒i和重组质粒ii；
9、将所述重组质粒i转入里氏木霉菌，中性纤维素酶的编码基因替代cbh1基因，获得一代里氏木霉菌；利用潮霉素抗性缺失，筛选中性纤维素酶活力最高的一代里氏木霉菌作为宿主，将所述重组质粒ii转入所述宿主，中性纤维素酶的编码基因替代cbh2基因，获得二代里氏木霉菌，再利用潮霉素抗性缺失筛选中性纤维素酶活力最高的二代里氏木霉菌即为所述里氏木霉工程菌。
10、优选的是，所述表达质粒i包含内源酸性纤维素酶基因cbh1的启动子和终止子，所述表达质粒ii包含内源酸性纤维素酶基因cbh2的启动子和终止子。
11、优选的是，所述重组质粒i包含内源酸性纤维素酶基因cbh1的启动子和终止子，以及中性纤维素酶的编码基因，所述重组质粒ii包含内源酸性纤维素酶基因cbh2的启动子和终止子，以及中性纤维素酶的编码基因。
12、本专利技术还提供所述的里氏木霉工程菌在生产中性纤维素酶中的应用。
13、本专利技术还提供一种生产中性纤维素酶的方法，包括将所述的里氏木霉工程菌发酵培养，从发酵液的上清液中获取中性纤维素酶的步骤。
14、本专利技术还提供所述的里氏木霉工程菌或利用所述的方法获取的中性纤维素酶在纺织领域中的应用。
15、优选的是，应用于石洗工艺。
16、本专利技术公开了以下技术效果：
17、本专利技术利用里氏木霉表达质粒构建中性纤维素酶表达模块，将中性纤维素酶的编码基因转化到里氏木霉基因组中，依次代替里氏木霉中分泌表达量最高的两个内源的酸性纤维素酶基因(cbh1和cbh2)。本专利技术成功构建了分泌表达中性纤维素酶的里氏木霉工程菌株。该工程菌株可用于中性纤维素酶的生产，生产的中性纤维素酶符合食品安全规范，无甲醇有毒性和易燃易爆的危险性，将更适合实际的食品、饲料和纺织行业的需求。
18、本专利技术还将构建的里氏木霉工程菌株表达的中性纤维素酶应用于石洗工艺中，发现所产生的中性纤维素酶能明显增加牛仔布石洗效果，对将里氏木霉工程菌株或其产生的中性纤维素酶应用到放置领域提供了科学依据。
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1.一种分泌表达中性纤维素酶的里氏木霉工程菌，其特征在于，其是在里氏木霉菌中异源表达中性纤维素酶得到，所述异源表达中性纤维素酶包括将所述里氏木霉菌中内源酸性纤维素酶基因cbh1和cbh2依次替换为所述中性纤维素酶的编码基因的步骤。
2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述中性纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述里氏木霉菌包括里氏木霉菌RUT-C30。
4.一种权利要求1-3任一项所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括利用中性纤维素酶的编码基因依次替代里氏木霉菌中内源酸性纤维素酶基因cbh1和cbh2的步骤。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述依次替代的方法包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组质粒I包含内源酸性纤维素酶基因cbh1的启动子和终止子，以及中性纤维素酶的编码基因，所述重组质粒II包含内源酸性纤维素酶基因cbh2的启动子和终止子，
7.如权利要求1-3任一项所述的里氏木霉工程菌在生产中性纤维素酶中的应用。
8.一种生产中性纤维素酶的方法，其特征在于，包括将权利要求1-3任一项所述的里氏木霉工程菌发酵培养，从发酵液的上清液中获取中性纤维素酶的步骤。
9.如权利要求要求1-3任一项所述的里氏木霉工程菌或利用权利要求8所述的方法获取的中性纤维素酶在纺织领域中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，应用于石洗工艺。
...【技术特征摘要】
1.一种分泌表达中性纤维素酶的里氏木霉工程菌，其特征在于，其是在里氏木霉菌中异源表达中性纤维素酶得到，所述异源表达中性纤维素酶包括将所述里氏木霉菌中内源酸性纤维素酶基因cbh1和cbh2依次替换为所述中性纤维素酶的编码基因的步骤。
2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述中性纤维素酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述里氏木霉菌包括里氏木霉菌rut-c30。
4.一种权利要求1-3任一项所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括利用中性纤维素酶的编码基因依次替代里氏木霉菌中内源酸性纤维素酶基因cbh1和cbh2的步骤。
5.如权利要求4所述的构建方...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁高爽，王玮，闻格，丁睿，陈雨蒙，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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