【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因工程，尤其涉及一种基于转运分泌途径制备重组人白蛋白的重组工程菌及应用。
技术介绍
1、毕赤酵母是发酵工业最广泛使用的模式微生物之一，以其为宿主的外源基因表达系统近年来发展迅速，广泛应用于生物医药、化妆品、饲料、工业酶制剂及基础研究等各个领域，在众多分泌表达系统中具有优势。毕赤酵母表达系统分泌途径主要为：目的基因转录成mrna后，在核糖体上合成新生肽链，通过内质网膜上的蛋白通道转运至内质网中进行折叠修饰，经由分泌系统中的质检元件检测正确折叠后，再被运输到高尔基体中进行糖基化修饰，形成特定结构并具有功能的蛋白质，最后通过囊泡运输分泌到细胞外。
2、随着科技的发展，提高异源蛋白质分泌的方法逐渐增多，其中最为传统的方法为提高重组蛋白编码基因拷贝数。理论上随着目的基因拷贝数的增加，蛋白表达量应随之增加；但然而，在实践过程中，当拷贝数增至一定数目时，由于转运分泌途径受阻等因素影响，限制了蛋白质的生产效率，其表达量反而下降，不利于实现增产的目的。
3、随着对异源蛋白在酵母中分泌表达的研究发现，不同蛋白的表达量差异较大，有些异源蛋白质分泌能力有限，限制了蛋白质的生产效率。因此通过对毕赤酵母蛋白转运分泌途径相关基因进行改造，维持蛋白质分泌途径的顺畅，对于提高蛋白质的分泌效率和产量至关重要。这为提高目标蛋白的产量提供了新的思路。
技术实现思路
1、针对现有技术中的问题与不足，本专利技术通过对宿主菌的转运分泌途径进行改造，解决了因拷贝数过度增加导致异源蛋白质产量降低
2、本专利技术第一方面，提供一种基于转运分泌途径制备重组人白蛋白的重组工程菌，所述重组工程菌在表达重组白蛋白的同时，还包括如下操作：通过基因重组技术将内质网相关基因、囊泡转运相关基因、高尔基体相关基因中的一种或多种重组表达盒整合至重组工程菌基因组中，其中：所述内质网相关基因选自srp54、erj5中的一种或多种；所述囊泡转运相关基因选自yos1、sly1中的一种或多种；所述高尔基体相关基因选自gos1、yip1中的一种或多种。
3、进一步地，所述srp54基因所编码的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述erj5基因所编码的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述yos1基因编码的氨基酸序列如seq idno.5所示；所述sly1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述gos1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.9所示；所述yip1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.11所示。
4、进一步地，所述srp54基因核苷酸序列为编码seq id no.1所述的氨基酸序列的核苷酸序列，包括已经公开的核苷酸序列或根据实际需要进行优化的核苷酸序列；所述erj5基因核苷酸序列为编码seq id no.3所述的氨基酸序列的核苷酸序列，包括已经公开的核苷酸序列或根据实际需要进行优化的核苷酸序列； 所述yos1基因核苷酸序列为编码seqid no.5所述的氨基酸序列的核苷酸序列；所述sly1基因核苷酸序列为编码seq id no.7所述的氨基酸序列的核苷酸序列；所述gos1基因核苷酸序列为编码seq id no.9所述的氨基酸序列的核苷酸序列；所述yip1基因核苷酸序列为编码seq id no.11所述的氨基酸序列的核苷酸序列。
5、优选地，所述srp54基因核苷酸序列如seq id no.2所示或与seq id no.2所示的核苷酸序列具有98%的同源性；所述erj5基因核苷酸序列如seq id no.4所示或与seq idno.4所示的核苷酸序列具有98%的同源性；所述yos1基因核苷酸序列如seq id no.6所示或与seq id no.6所示的核苷酸序列具有98%的同源性；所述sly1基因核苷酸序列如seq idno.8所示或与seq id no.8所示的核苷酸序列具有98%的同源性；所述gos1基因核苷酸序列如seq id no.10所示或与seq id no.10所示的核苷酸序列具有98%的同源性；所述yip1基因核苷酸序列如seq id no.12所示或与seq id no.12所示的核苷酸序列具有98%的同源性。
6、进一步地，所述重组工程菌中至少包含1个拷贝的编码重组人白蛋白的表达盒。优选的，所述重组工程菌中编码重组人白蛋白的核苷酸序列拷贝数为2~6，在本专利技术实施例中，所述重组工程菌中编码重组人白蛋白的核苷酸序列拷贝数为4。
7、进一步地，所述重组工程菌还包括启动子序列、筛选信号肽序列中的至少一种。优选表达盒包含：aox1启动子、a-factor信号肽和人白蛋白核苷酸序列。
8、进一步地，本专利技术所述的重组工程菌还包括抗药性基因片段。所述抗药性基因片段用于重组工程菌的筛选，在本专利技术的实施例中，所述抗药性片段为博来霉素、杀稻瘟菌素抗性、潮霉素b、遗传霉素g418抗性基因中的一种或多种。
9、进一步地，所述重组工程菌中还包括信号肽序列，所述信号肽序列用于重组工程菌外源蛋白的分泌表达，在本专利技术的实施例中，所述重组工程菌中信号肽序列为酿酒酵母a交配因子信号肽；优选的，编码所述酿酒酵母a交配因子信号肽的核苷酸序列如seq idno.13所示。
10、进一步地，编码srp54、erj5、yos1、sly1、gos1、yip1中至少一种基因的重组表达盒在相同选择标志的核酸构建体上或在不同选择标志的核酸构建体上。
11、进一步地，所述重组工程菌选自毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母、酿酒酵母中的一种或多种。优选地，所述重组工程菌为毕赤酵母；更优选的，所述毕赤酵母为cbs7435。
12、本专利技术第二方面，提供所述重组工程菌在制备重组白蛋白和/或提高重组白蛋白的表达量方面的应用。
13、本专利技术第三专利技术，提供一种制备所述重组工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括通过基因重组技术将内质网相关基因、囊泡转运相关基因、高尔基体相关基因中的一种或多种重组表达盒整合至重组工程菌基因组中的步骤，其中：所述内质网相关基因选自srp54、erj5中的一种或多种；所述囊泡转运相关基因选自yos1、sly1中的一种或多种；所述高尔基体相关基因选自gos1、yip1中的一种或多种。
14、本专利技术第四方面，提供一种制备重组白蛋白的方法，所述方法包括：采用所述重组工程菌发酵制备重组白蛋白的步骤。
15、本专利技术的有益效果包括但不限于：
16、本专利技术提供了一种基于转运分泌途径制备重组人白蛋白的重组工程菌，能显著提高人重组白蛋白的表达量。本专利技术通过过表达内质网相关基因srp54、erj5，囊泡转运相关基因yos1、sly1，高尔基体相关基因gos1、yip1中的一种或多种，强化蛋白质转运途径，维持分泌顺畅，显著增强了异源蛋白的分泌能力，解决了因拷贝数过度增加导致产量下降的问题。该方法在提升具有高经济价值蛋白产量方面展本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于转运分泌途径制备重组人白蛋白的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌在表达重组白蛋白的同时，还包括如下操作：通过基因重组技术将内质网相关基因、囊泡转运相关基因、高尔基体相关基因中的一种或多种重组表达盒整合至重组工程菌基因组中，其中：
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述SRP54基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述ERJ5基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述YOS1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SLY1基因所编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示；所述GOS1基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述YIP1基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3. 根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述SRP54基因核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述ERJ5基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述YOS1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述SLY1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述GOS1基因
4.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌中至少包含1个拷贝的编码重组人白蛋白的表达盒。
5.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌还包括启动子序列、筛选信号肽序列中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，编码SRP54、ERJ5、YOS1、SLY1、GOS1、YIP1中至少一种基因的重组表达盒在相同选择标志的核酸构建体上或在不同选择标志的核酸构建体上。
7.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌选自毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母、酿酒酵母中的一种或多种。
8.如权利要求1-7任一所述重组工程菌在制备重组白蛋白和/或提高重组白蛋白的表达量方面的应用。
9.一种制备权利要求1-7任一所述重组工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括通过基因重组技术将内质网相关基因、囊泡转运相关基因、高尔基体相关基因中的一种或多种重组表达盒整合至重组工程菌基因组中的步骤，其中：
10.一种制备重组白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求1-7任一所述的重组工程菌发酵制备重组白蛋白的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种基于转运分泌途径制备重组人白蛋白的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌在表达重组白蛋白的同时，还包括如下操作：通过基因重组技术将内质网相关基因、囊泡转运相关基因、高尔基体相关基因中的一种或多种重组表达盒整合至重组工程菌基因组中，其中：
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述srp54基因所编码的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述erj5基因所编码的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述yos1基因编码的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述sly1基因所编码的氨基酸序列如seq idno.7所示；所述gos1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.9所示；所述yip1基因所编码的氨基酸序列如seq id no.11所示。
3. 根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述srp54基因核苷酸序列如seqid no.2所示；所述erj5基因核苷酸序列如seq id no.4所示；所述yos1基因核苷酸序列如seq id no.6所示；所述sly1基因核苷酸序列如seq id no.8所示；所述gos1基因核苷酸序列如seq id no.10所示；所述yip1基因核苷酸序列如seq i...
【专利技术属性】
技术研发人员：项炜，韩旭，姜钧茹，李爽，龚国利，
申请(专利权)人：通化安睿特生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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