【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学材料领域，具体涉及用于骨软骨修复的功能化壳聚糖纳米纤维支架，同时还涉及该支架的制备方法及其在骨软骨修复方面的应用。
技术介绍
1、骨软骨损伤是指软骨及软骨下骨的损伤。软骨是一种高度特化的组织，一旦受伤，在体内不能自发再生。骨软骨损伤的修复需要同时再生软骨和软骨下骨，治疗非常困难，一直是临床实践中的难题。目前临床上对骨软骨损伤修复和再生的治疗方法主要有微骨折和自体骨软骨移植，但存在易形成纤维软骨、供体来源有限等问题。组织工程为骨软骨损伤的治疗提供了新的途径。骨软骨支架材料根据骨和软骨组织修复不同的微环境和性能需求，逐渐由单层向双层、多层转变。骨层支架含有大量的磷酸钙等无机成分，软骨层支架以细胞外基质为主、力学性能要求不高。根据骨软骨组成结构和成分的不同构建骨软骨复合支架使骨软骨良好修复具有重要现实意义。
2、骨软骨修复移植物目前的构建方法主要有3d打印技术和多层水凝胶。3d打印技术可以将不同材料按照不同层级的需求打印出具有理想结构的支架，但对于骨层和软骨层需要不同性质的材料进行打印时，两相材料易分离是一个难以解决的问题。水凝胶材料多以有机材料为主体，改性或掺杂无机成分提高其力学强度后可作为水凝胶的骨层部分，但简单掺杂难以呈现无机物纳米结构特征。水凝胶培养的细胞往往仅在水凝胶表层生长，组织修复是随着水凝胶的降解，新生组织才逐渐填补缺损；水凝胶支架结合3d打印可使细胞长入，但其各层之间的粘附性不足；水凝胶制备过程中直接负载细胞也有相关研究，该方法对制备条件要求苛刻，且细胞在水凝胶内部生存状态不佳。目前
3、因此，构建一种模拟骨软骨修复微环境，可以募集干细胞、促进间充质干细胞的成骨和成软骨分化，满足骨与软骨的不同力学性能、微环境的多功能生物活性多孔支架，修复骨软骨损伤，具有重要的临床和社会意义。
技术实现思路
1、本专利技术目的之一提供用于骨软骨修复的功能化壳聚糖纳米纤维支架。本专利技术以壳聚糖纳米短纤维为主要材料，经改性使其具备促成软骨分化和促成骨分化的功能，构筑具有纳米微环境的壳聚糖纳米纤维支架，募集间充质干细胞促成骨、成软骨分化修复骨软骨损伤。
2、为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：用于骨软骨修复的功能化壳聚糖纳米纤维支架材料，至少包括软骨修复层和骨修复层，其中，所述软骨修复层由接枝kgn的壳聚糖纳米纤维构成，所述骨修复层由肝素改性并经矿化的壳聚糖纳米纤维构成，即所述软骨修复层由kgn改性壳聚糖纳米纤维构成，所述骨修复层由矿化的肝素改性壳聚糖纳米纤维支架构成。
3、本专利技术壳聚糖纳米纤维采用的壳聚糖纳米短纤维，其纳米结构与天然细胞外基质相似，分散在水中表现出正电性，以其作为支架材料可使细胞在三维空间生长，促进细胞黏附。肝素改性后的壳聚糖纳米纤维经体外矿化后其表面可以形成均匀的磷酸钙纳米片，形成以壳聚糖纳米纤维为骨架，磷酸钙纳米片均匀分布的有机-无机复合结构，构建骨层微环境促进间充质干细胞成骨分化。壳聚糖纳米纤维接枝kartogenin(2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸，kgn)后，具有促成软骨分化的作用，降解产物是软骨细胞外基质的组成成分。功能化壳聚糖纳米纤维通过改性和矿化赋予其促成软骨分化和促成骨分化的功能，构筑具有纳米微环境的壳聚糖纳米纤维支架，募集间充质干细胞促成骨、成软骨分化修复骨软骨损伤。
4、进一步地，软骨修复层和骨修复层之间具有骨软骨界面层，由高固含量的壳聚糖纳米纤维构成。骨软骨界面层中为未改性的壳聚糖纳米纤维可以更好地连接软骨层和骨层支架，并起到阻隔作用，防止骨层血管长入软骨层。
5、本专利技术各层采用壳聚糖纳米纤维为基体，通过纳米纤维之间的物理缠结，使得层与层之间实现连接。专利技术人在实验过程中，发现直径为5μm以下，长度5mm以下的壳聚糖纳米纤维能够达到较佳的效果，而壳聚糖纳米纤维尺寸过大，各层之间的连接变差，且支架成型不佳，而直径在50nm以下可能会产生细胞毒性。因此，作为本专利技术的实施例，在本专利技术中，所用壳聚糖纳米纤维优选为直径为5μm以下，长度5mm以下的壳聚糖纳米纤维，其可由壳聚糖纤维经化学或机械处理后得到，也可由壳聚糖粉末经化学或机械处理得到。
6、优选地，壳聚糖纳米纤维直径为1μm以下，长度在1mm以下的纤维。
7、在本专利技术中，在软骨修复层的kgn相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.001～1。优选地，软骨修复层的kgn相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.01～0.1。
8、在本专利技术中，在骨修复层的肝素相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.01～5。优选地，骨修复层的肝素相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.1～2。
9、本专利技术目的之二是提供上述功能化壳聚糖纳米纤维支架材料的应用。
10、具体涉及，功能化壳聚糖纳米纤维支架作为修复骨软骨支架的应用。
11、本专利技术的目的之三是提供上述功能化壳聚糖纳米纤维支架的制备方法。
12、具体地，功能化壳聚糖纳米纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
13、(1)kgn改性壳聚糖纳米纤维制备：取kgn、壳聚糖纳米纤维和偶联剂混合，进行偶联反应，得kgn改性壳聚糖纳米纤维分散液；
14、(2)肝素改性壳聚糖纳米纤维支架制备：取肝素、壳聚糖纳米纤维和偶联剂混合，进行偶联反应，反应结束去除未反应的物质，制备肝素改性壳聚糖纳米纤维分散液，加入交联剂混合，进行交联反应，冷冻成型，干燥，得肝素改性壳聚糖纳米纤维支架；
15、(3)肝素改性壳聚糖纳米纤维矿化：将肝素改性壳聚糖纳米纤维支架于矿化液浸泡矿化，得矿化肝素壳聚糖纳米纤维支架；
16、(4)kgn改性壳聚糖纳米纤维分散液中加入交联剂混合均匀，注入模具中，然后放置矿化后的肝素壳聚糖纳米纤维支架，静置，冷冻，干燥，即得。
17、步骤(1)中，kgn相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.001～1，反应温度为5℃～40℃，反应在edc/nhs催化条件下进行，反应时间为12小时～48小时。
18、优选地，kgn相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.01～0.1，反应温度为25℃，反应时间为24小时。
19、步骤(2)中，肝素相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.01～5，反应温度为5℃～40℃，反应在edc/nhs催化条件下进行，反应时间为12小时～48小时。
20、优选地，肝素相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.1～2，反应温度为25℃，反应时间为24小时。
21、edc为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和nhs为n-羟基琥珀酰亚胺。
22、在本专利技术中，所述步骤(1)的kgn改性壳聚糖纳米纤维分散液和所述步骤(2)的肝素改性壳聚糖纳米本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于骨软骨修复的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，至少包括软骨修复层和骨修复层，其中，所述软骨修复层由KGN改性壳聚糖纳米纤维构成，所述骨修复层由矿化的肝素改性壳聚糖纳米纤维支架构成。
2.根据权利要求1所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，所述软骨修复层和骨修复层之间具有骨软骨界面层，由壳聚糖纳米纤维构成。
3.根据权利要求1或2所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，所述壳聚糖纳米纤维的直径为5μm以下，长度5mm以下。
4.根据权利要求1所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，所述KGN改性壳聚糖纳米纤维中KGN相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.001～1；所述矿化的肝素改性壳聚糖纳米纤维支架中的肝素相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.01～5。
5.权利要求1-4任一项所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架作为修复骨软骨支架的应用。
6.权利要求1所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的功能化壳聚糖纳米纤维骨软骨支架的制备方法，其特征是，所述步骤
8.根据权利要求6所述的功能化壳聚糖纳米纤维骨软骨支架的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的KGN改性壳聚糖纳米纤维分散液和所述步骤(2)的肝素改性壳聚糖纳米纤维分散液的壳聚糖纳米纤维固含量在0.1wt％～20wt％之间。
9.根据权利要求6所述的功能化壳聚糖纳米纤维骨软骨支架的制备方法，其特征是，所述步骤(2)中，肝素改性壳聚糖纳米纤维分散液中加入体积比为0.01％～10％的交联剂，在10℃～90℃交联反应4小时～48小时，转入冰箱中冷冻，干燥，获得成型的肝素改性壳聚糖纳米纤维支架；
10.根据权利要求6所述的功能化壳聚糖纳米纤维骨软骨支架的制备方法，其特征是，当支架具有骨软骨界面层时，所述步骤(4)则为：在模具中注入混合交联剂的KGN改性壳聚糖纳米纤维分散液，然后注入混合交联剂的壳聚糖纳米纤维分散液，然后放置矿化肝素壳聚糖纳米纤维支架，静置，冷冻，干燥，即得。
...【技术特征摘要】
1.用于骨软骨修复的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，至少包括软骨修复层和骨修复层，其中，所述软骨修复层由kgn改性壳聚糖纳米纤维构成，所述骨修复层由矿化的肝素改性壳聚糖纳米纤维支架构成。
2.根据权利要求1所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，所述软骨修复层和骨修复层之间具有骨软骨界面层，由壳聚糖纳米纤维构成。
3.根据权利要求1或2所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，所述壳聚糖纳米纤维的直径为5μm以下，长度5mm以下。
4.根据权利要求1所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架，其特征是，所述kgn改性壳聚糖纳米纤维中kgn相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.001～1；所述矿化的肝素改性壳聚糖纳米纤维支架中的肝素相对于壳聚糖纳米纤维的质量比为0.01～5。
5.权利要求1-4任一项所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架作为修复骨软骨支架的应用。
6.权利要求1所述的功能化壳聚糖纳米纤维支架的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的功能化壳聚糖纳米纤维骨软骨支架的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢登辉，张思晗，郭金山，
申请(专利权)人：南方医科大学第三附属医院广东省骨科研究院，
类型：发明
国别省市：
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