【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析，具体涉及一种rt-rpa整合支架crrna转录扩增激活cas12a用于mirna一锅法检测生物传感器的制备及其应用。
技术介绍
1、micrornas(mirnas)是一类小型非编码rna分子，它们在调控基因表达中扮演着关键角色，并且已被广泛记录为参与发育过程和疾病发病机制。特别值得注意的是，与正常组织相比，mirnas在癌症组织中的表达显著过高，这突显了它们作为癌症生物标志物的潜力。此外，这些分子在癌症增殖、迁移、药物抗性和肿瘤微环境中的免疫调节中发挥着关键作用，这进一步强调了它们在肿瘤形成和癌症进展中的重要性。因此，mirnas的精准检测对于理解它们的调控机制以及作为疾病诊断和预后生物标志物的潜力至关重要。由于mirnas的短序列和家族成员之间的高同源性，mirnas的高灵敏检测面临重大挑战。传统的mirnas检测方法，主要包括定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)、第二代测序和northern印迹等。然而，使用这些技术需要昂贵的设备和试剂、熟练的技术人员，以及复杂的样品制备和处理程序，所以这些都限制了它们的实际应用和发展。因此，开发一种方便、低成本、超灵敏的mirna检测策略变得至关重要。
2、crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统，尤其是基于crispr-cas12a的系统，在分子检测领域取得了显著进展。然而，crispr系统在检测灵敏度、目标范围和激活机制方面存在局限性。为了提高检测的灵
3、split crrna在crispr-cas12a系统中作为一种创新方法出现，增强了分子诊断的检测能力。这种方法涉及将crrna分成两个不同的部分：一个保守序列的支架crrna和可变序列的间隔rna。最近的研究已经证明，这两部分可以与cas12a蛋白重新组装，形成一个核糖核蛋白(rnp)复合物与野生型cas12a rnp具有相同切割能力。split crrna系统已经被证明对于检测mirna和非编码rna，具有高度的灵敏度和特异性，但目标rna会形成二级结构会对其产生干扰。研究表明，在移除支架序列后，cas12a也可以通过单个的crrna间隔序列靶向体外目标dna的切割。但是，该实验需要较高浓度的crrna，可能会增加非特异性结合和脱靶效应的风险。因此，构建新的便捷又灵敏的split crrna与cas12a联用的生物传感器来检测mirna是非常必要的。
技术实现思路
1、鉴于现有技术的不足，本专利技术提出了一种一锅法rt-rpa整合scaffold crrna转录扩增激活cas12a用于mirna检测的生物传感器，具有快速、高灵敏、高特异、可视化和低设备要求的优势。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、1.一种rt-rpa协助支架crrna转录扩增激活cas12a反式切割用于mirna一锅法检测生物传感器，该生物传感器包括rt-rpa扩增、scaffold crrna转录扩增和crispr系统三个部分：
4、(1)rt-rpa扩增包括：特异性识别microrna的茎环探针、10×rt mix、hiscriptⅱ酶混合物、era basic、带有t7启动子的rpa上游引物和rpa下游引物；
5、(2)scaffold crrna转录扩增包括：split t7-1(包含scaffold crrna序列和t7启动子互补序列和能够与靶rna区域的一半结合的互补序列)、split t7-2(包含t7启动子的部分序列(4nt)和一个能够与靶rna区域的另一半结合的序列)、split t7-3(包含t7启动子(16nt)的部分序列)、t7rna聚合酶和ntps；
6、(3)crispr系统：cas12a蛋白和报告探针f-q。
7、2.将mir-155和茎环探针连接，逆转录出cdna。经过rpa扩增出带有t7启动子的双链。然后在t7rna聚合酶的作用下转录出目标rna。目标rna与split t7-1，split t7-2，split t7-3连接形成一个三向连接体并带有缺口位点的双链t7启动子；
8、3.步骤1所述的三向连接体带有scaffold crrna转录模版，scaffold crrna经转录后，与split t7-1上dna转录模板的黏性末端结合形成dna-rna杂交复合物。该dna-rna杂交复合物和scaffold crrna共同组装，形成类似split crrna功能，激活cas12a蛋白切割fq报告物，产生荧光信号，dna-rna形成的复合物在该系统中充当激活剂和spacer crrna的作用；
9、4.优选的，所述的21nt长度的rna序列既充当scaffold crrna，又充当spacercrrna；
10、5.优选的，所述的生物传感器用于一锅法mir-155超灵敏高效检测；
11、6.优选的，所述的生物传感器用于癌细胞以及血清样本的诊断。
12、相对于现有技术，本专利技术所述的一锅法rt-rpa整合scaffold crrna转录扩增激活cas12a反式切割用于mirna检测的生物传感器具有以下优势；
13、在这项专利技术中，我们使用了21个核苷酸的保守序列，它既作为scaffold crrna也作为spacer crrna，可以充当split crrna功能。支架rna的dna转录模板可以作为激活链，他们共同作用可以激活cas12a反式切割活性。通过转录split crrna，其中一部分与转录模板的黏性末端结合形成dna-rna杂交体。scaffold crrna与dna-rna杂交体复合物激活cas12a的反式切割活性。基于这一发现，我们构建了一种新型生物传感器，将逆转录重组酶聚合酶扩增与crispr-cas12a系统整合，实现了对mirna的超灵敏一锅法检测。这种集成检测显著提高了检测的灵敏度，同时简化了程序步骤，从而使检测方法更加快速和简便。我们首先将mirna逆转录成cdna，然后通过重组酶聚合酶将cdna扩增成带有t7启动子的双链dna。双链dna经过t7转录产生rn本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RT-RPA整合支架crRNA转录扩增激活Cas12a反式切割用于miRNA一锅法检测生物传感器，其特征在于，该生物传感器包括RT-RPA扩增、scaffold crRNA转录扩增和CRISPR系统三个部分：
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，将miR-155和茎环探针连接，逆转录出cDNA。经过RPA扩增出带有T7启动子的双链。然后在T7 RNA聚合酶的作用下转录出目标RNA。目标RNA与split T7-1，split T7-2，split T7-3连接形成一个三向连接体并带有缺口位点的双链T7启动子。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，三向连接体开始转录出scaffoldcrRNA，随后scaffold crRNA又与split T7-1上DNA转录模板的黏性末端结合形成DNA-RNA杂交复合物。该DNA-RNA杂交复合物和scaffold crRNA共同组装，形成类似split crRNA功能，激活Cas12a蛋白切割FQ报告物，产生荧光信号，DNA-RNA形成的复合物在该系统中充当激活剂和spacer crRN
4.根据权利要求1-3所述的生物传感器，其特征在于，转录出的21nt长度的RNA序列既充当scaffold crRNA，又充当spacer crRNA。
5.根据权利要求1-4所述的生物传感器，其特征在于，用于一锅法miR-155超灵敏高效检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用于癌细胞以及血清样本的诊断。
...【技术特征摘要】
1.一种rt-rpa整合支架crrna转录扩增激活cas12a反式切割用于mirna一锅法检测生物传感器，其特征在于，该生物传感器包括rt-rpa扩增、scaffold crrna转录扩增和crispr系统三个部分：
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，将mir-155和茎环探针连接，逆转录出cdna。经过rpa扩增出带有t7启动子的双链。然后在t7 rna聚合酶的作用下转录出目标rna。目标rna与split t7-1，split t7-2，split t7-3连接形成一个三向连接体并带有缺口位点的双链t7启动子。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，三向连接体开始转录出scaffoldcrrna，随后scaffold cr...
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