【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体涉及一种诱导δ-珠蛋白基因高表达的方法、组合物及应用。
技术介绍
1、血红蛋白由珠蛋白和血红素构成，在人体内主要起到携氧和输氧作用。健康成人血红蛋白95％为hba，由2条α珠蛋白链和两条β珠蛋白构成；2％-3.5％为hba2，由2条α珠蛋白链和两条δ珠蛋白构成。
2、β地中海贫血(β-thalassemia)是一组遗传性溶血性疾病，主要因基因突变或基因缺失引起血红蛋白β链合成减少，从而导致α、β链合成比例失调，α链堆积，最终引起溶血等一系列改变。目前治疗地中海贫血的主要治疗方案主要为定期输血、祛铁治疗，但该方案依然存在多脏器功能的慢性损伤问题。造血干细胞移植被认为是根治地贫的有效方案，但大多数患者难以获取合适配型，且异体移植术后有不同程度的移植物抗宿主反应(gvhd)，此外移植治疗费用高昂也其难以推广。
3、近年来基因编辑技术取得了巨大进步，crispr-cas9、碱基编辑器、先导编辑器等技术的出现更是将基因编辑技术的应用前景变得更加广泛。已有多项使用crispr-cas9进行基因编辑进行临床治疗β地中海贫血/镰状细胞病的方案在进行，且取得令人瞩目的成功。δ珠蛋白也是类β珠蛋白的一种，它与α珠蛋白结合形成hba2(α2δ2)，在成人期是一种普遍存在的有效血红蛋白，但其含量极低。有研究表明hba2与氧的亲和力更低，且hba2在细胞中普遍存在，而hbf只在10％-30％的细胞内存在，因此认为hba2是比hbf(α2γ2)更适合作为替代治疗β缺失的一种珠蛋白。δ珠蛋白可平衡由β珠蛋白
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种诱导δ-珠蛋白基因高表达的方法、组合物及应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供一种诱导δ-珠蛋白基因高表达的方法，通过基因编辑技术在hbd基因调控区的正义链或反义链人工引入调控基序；
4、所述人工引入的位点包括hbd的tss上游-64至-68之间、上游-89至-81之间、上游-93至-85之间、上游-100至-92之间、上游-108至-100之间、上游-119至-111之间、上游-1470至-1454之间、tss-78至-62之间、下游+214至+229之间、下游+1375至+1391之间、下游+1703至+1719之间中的至少一种；
5、所述调控基序为ccncaccct、ntg-n(7-8)-wgatar、ccaat中的至少一种；或gggtgngg、ytatcw-n(7-8)-can、attgg中的至少一种；
6、所述n为a、t、g、c中的任意一种；所述w为t或a；所述r为a或g；所述y为t或c。
7、本专利技术利用基因编辑技术，编辑hbd基因诱导δ珠蛋白的高表达。该方法在hbd基因的启动子区域引入ccncaccct、ntg-n(7-8)-wgatar和/或ccaat基序或其反义互补链，在hbd基因的非编码区域形成正向调控原件，促进δ珠蛋白在造血干/祖细胞中的高表达。
8、作为本专利技术所述的方法的优选实施方式，所述人工引入的方式包括删除序列、插入序列、序列突变中的至少一种。
9、作为本专利技术所述的方法的优选实施方式，所述调控基序为ccaat、ccacaccct、ttatcaattctactcag、ttatcttaaaccaacag、ctggggtttctgatag、ctatctcttctccgcag、ctggctctacagatag中的任意一种。
10、作为本专利技术所述的方法的优选实施方式，所述基因编辑技术利用crispr-cas编辑系统、碱基编辑器(be)、先导编辑器(prime editing，pe)、talen、zfn等编辑系统中的任意一种。
11、作为本专利技术所述的方法的进一步的优选实施方式，所述crispr-cas编辑系统使用的ssodn的核苷酸序列包括如seq id no.17至seq id no.22、seq id no.50至seq idno.54中所示的至少一种序列，或者其对应的反义互补序列；
12、使用的sgrna的核苷酸序列包括如seq id no.25至seq id no.28、seq id no.56至seq id no.60中所示的至少一种序列；和/或，所述grna还包含化学修饰，优选3'-硫代磷酸酯、2'-o-甲酯、2'-o-甲基、2'-f修饰、2'-核糖3'-硫代磷酸酯、脱氧和5'磷酸酯修饰的一种或多种；更优选所述grna的5’端和3’端的三个核糖核苷酸进行2'-o-甲基修饰，5’端和3’端的四个核糖核苷酸之间进行硫代磷酸酯键修饰。第二方面，本专利技术提供一种用于δ-珠蛋白基因调控区基因编辑的组合物，包括ssodn；所述ssodn中含有ccncaccct、ntg-n(7-8)-wgatar、ccaat中的至少一种；或gggtgngg、ytatcw-n(7-8)-can、attgg中的至少一种；
13、所述n为a、t、g、c中的任意一种；所述w为t或a；所述r为a或g；所述y为t或c。
14、作为本专利技术所述的组合物的优选实施方式，所述ssodn核苷酸序列包括如seq idno.17至seq id no.22、seq id no.50至seq id no.54中所示的至少一种序列，或者其对应的反义互补序列。
15、(1)所述ssodn中的ccncaccct、ntg-n(7-8)-wgatar、ccaat、gggtgngg、ytatcw-n(7-8)-can、attgg序列位于ssodn上任意位置，包括替换序列、5’同源臂、3’同源臂、5’同源臂与替换序列连接处或3’同源臂与替换序列连接处；
16、(2)所述5’同源臂和3’同源臂是对称的，或者是非对称的；
17、(3)所述5’同源臂和/或3’同源臂选自所述ζ-珠蛋白基因的非编码区的正义链或反义链；
18、(4)所述ssodn中5’同源臂的3’末端与3’同源臂的5’末端相距0-20个碱基；
19、(5)所述5′同源臂和/或3′同源臂的长度为20～300nt；和，
20、(6)所述替换序列的碱基数量为0-6个。
21、所述ssodn经化学修饰例如硫代磷酸酯修饰；所述化学修饰优选为对所述ssodn的5′末端和3′末端进行修饰；更优选为对所述ssodn的5’末端和3’末端的前3个核苷酸进行修饰。
22、作为本专利技术所述的组合物的进一步的优选实施方式，所述组合物还包括sgrna；所述sgrna的核苷酸序列包括如seq id no.25至seq id no.28、seq id no.56至seq idno.60中所示的至少一种序列。
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【技术保护点】
1.一种诱导δ-珠蛋白基因高表达的方法，其特征在于，通过基因编辑技术在HBD基因调控区的正义链或反义链人工引入调控基序；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控基序为CCAAT、CCACACCCT、TTATCAATTCTACTCAG、TTATCTTAAACCAACAG、CTGGGGTTTCTGATAG、CTATCTCTTCTCCGCAG、CTGGCTCTACAGATAG中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术利用CRISPR-Cas编辑系统、碱基编辑器、先导编辑器、TALEN、ZFN等编辑系统中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas编辑系统使用的ssODN的核苷酸序列包括如SEQ ID No.17至SEQ ID No.22、SEQ IDNo.50至SEQ ID No.54中所示的至少一种序列，或者其对应的反义互补序列；
5.一种用于δ-珠蛋白基因调控区基因编辑的组合物，其特征在于，包括ssODN；所述ssODN中含有CCNCACCCT、NTG-N
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述ssODN核苷酸序列包括如SEQ IDNo.17至SEQ ID No.22、SEQ ID No.50至SEQ ID No.54中所示的至少一种序列，或者其对应的反义互补序列。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列包括如SEQ ID No.25至SEQ ID No.28、SEQ ID No.56至SEQ ID No.60中所示的至少一种序列。
8.一种用于δ-珠蛋白基因调控区基因编辑的试剂，其特征在于，包括权利要求5-7任一所述的组合物。
9.一种造血干/祖细胞，其特征在于，将权利要求5-7任一所述的组合物转入造血干细胞中而得。
10.权利要求5-7任一所述的组合物、权利要求9所述的造血干/祖细胞在制备用于治疗β-血红蛋白缺失或突变导致的疾病的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种诱导δ-珠蛋白基因高表达的方法，其特征在于，通过基因编辑技术在hbd基因调控区的正义链或反义链人工引入调控基序；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控基序为ccaat、ccacaccct、ttatcaattctactcag、ttatcttaaaccaacag、ctggggtttctgatag、ctatctcttctccgcag、ctggctctacagatag中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术利用crispr-cas编辑系统、碱基编辑器、先导编辑器、talen、zfn等编辑系统中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述crispr-cas编辑系统使用的ssodn的核苷酸序列包括如seq id no.17至seq id no.22、seq idno.50至seq id no.54中所示的至少一种序列，或者其对应的反义互补序列；
5.一种用于δ-珠蛋白基因调控区基因编辑的组合物，其特征在于，包括ssodn；所述ssodn中含有ccncaccc...
【专利技术属性】
技术研发人员：方建培，陈丽妮，梁峻彬，徐辉，李欣瑜，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：
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