【技术实现步骤摘要】
本申请涉及甲基化测序，特别是微量或降解基因组dna的甲基化文库制备。本申请还涉及用于微量或降解基因组dna的甲基化文库的试剂盒。本申请的方法和试剂盒特别适用于对甲基化目标区域进行测序分析，且该方法和试剂盒适合微量或降解性严重的样本的文库构建。
技术介绍
1、第二代高通量测序也称为下一代测序技术，可以实现一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定。现阶段，二代测序在科研上主要应用于基因组测序、转录组测序、群体测序、扩增子测序、宏基因组测序、重测序等。而临床方面，在辅助生殖，如非侵入性产前检查(non-invasive prenatal test，nipt)；遗传性疾病，如遗传性致病突变筛查；肿瘤研究，如早期诊断，用药指导，预后判断等中发挥着越来越重要的作用。
2、dna甲基化是基因组dna的一种主要表观遗传修饰形式。近年来的大量研究表明，dna异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。甲基化测序的一个金标准是全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing，wgbs)，简称bs-seq。其检测原理是用重亚硫酸盐处理，将基因组中未发生甲基化的c碱基转换成u，进行pcr扩增后变成t，与原本具有甲基化修饰的c碱基区分开来，再结合高通量测序技术，与参考序列比对，即可判断cpg/chg/chh位点是否发生甲基化。要实现这一过程，首先需要对基因组进行文库构建，加上适合的接头，然后在测序平台上进行测序。而根据重亚硫酸盐在文库构建过程中加入的不同顺序，可以文库构建分成转化前建库(p
3、而市场上有诸多测序平台，illumina平台凭借其超低的测序成本和可以接受的读长，成为了目前最主流的二代测序公司。本专利技术开发了一种低样本起始量下进行wgbs文库构建的方法。其产物可以用于杂交捕获，数据利用率很高。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种用于微量或降解基因组dna的甲基化文库制备方法及其试剂盒。在文库构建过程中，对用到的接头进行了改进，流程上进行了优化，使得其可用于全基因组重亚硫酸盐测序(wgbs)和用于杂交快速建库。本申请的dna文库制备方法，同时也可以用于甲基化目标区域测序。在杂交捕获流程中进行验证，取得很好的效果，且测序指标优于市面上转化后建库试剂盒的效果(去重后有效测序深度等重要指标，见附图)。同时该方法也能适合微量或降解性严重的样本的文库构建，最低起始量低至1ng。
2、本申请的具体技术方案如下：
3、1.构建全基因组甲基化文库的方法，包括以下步骤：
4、(1)从生物样本中提取并分离目的基因组dna；
5、(2)对提取后的基因组dna进行重亚硫酸盐转化；
6、(3)在基因组dna片段的5'端加上一个磷酸；
7、(4)用连接酶将接头1连接至基因组dna片段的一端，对连接有接头1的所述基因组dna片段进行捕获和纯化；
8、(5)再次用连接酶将接头2连接到基因组dna片段的另一端，对连接有接头1和2的所述基因组dna片段进行捕获和纯化；
9、(6)通过pcr扩增文库并纯化产物得到全基因组甲基化文库；
10、其中所述接头1和接头2的长度分别为30-50个核苷酸，优选所述接头1和接头2的长度分别为32-45个核苷酸，更优选所述接头1和接头2的长度分别为33-42个核苷酸；
11、所述生物样本可以是新鲜组织、ffpe样本即福尔马林固定石蜡包埋样本或血浆。
12、2.根据项1所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中所述步骤(4)和步骤(5)中的捕获和纯化步骤是用磁珠或纯化柱完成的；所述纯化柱优选为zymo的货号为c1003-50的纯化柱。
13、3.根据项1或2所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，当所述生物样本为新鲜组织或ffpe样本即福尔马林固定石蜡包埋样本时，在步骤(1)中还有对基因组dna进行片段化的步骤；进行片段化的方法选自雾化、超声片段化、或hydroshear处理。
14、4.根据项3所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中在所述片段化步骤中，将所述基因组dna打断至300-400bp的片段；步骤(6)中的所述纯化步骤用磁珠纯化。
15、5.根据项1-4中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，所述步骤(4)中的所述接头1含有seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列、或由如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列组成；所述步骤(5)中的所述接头2含有seq id no:3和seqid no:4所示的核苷酸序列、或由如seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列组成。
16、6.根据项5所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中：
17、seq id no:1所示序列的5’端被磷酸化；seq id no:2的5’端不被磷酸化，3’端被封闭基团封闭；所述封闭基团优选为碳间隔、双脱氧核苷酸等；
18、seq id no:3所示序列的5’端被磷酸化；seq id no:4的5’端不被磷酸化，3’端不被封闭基团封闭。
19、7.根据项1-6任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中在步骤(3)中含有dna变性步骤。
20、8.根据项1-7中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其用于纳克级别的基因组dna，优选1ng-20ng，更优选1ng-10ng，更优选1ng-5ng，更优选1ng-3ng，最优选1ng。
21、9.根据项1-4中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中步骤(4)和(5)中磁珠的用量为0.8-2倍，优选为1-1.2倍。
22、10.根据项1-4中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中步骤(4)和(5)中所用的连接酶选自以下一种或多种：nad-依赖性连接酶，比如taq dna连接酶、丝状栖热菌(thermus filiformis)dna连接酶、大肠杆菌(e.coli)dna连接酶、tth dna连接酶、水管致黑栖热菌(thermus scotoductus)dna连接酶(i和ii)、热稳定连接酶、ampligase热稳定dna连接酶、vanc-型连接酶和9°n dna连接酶；和atp-依赖性连接酶，其包括t4rna连接酶在内、t4 dna连接酶、t3 dna连接酶、t7 dna连接酶、pfu dna连接酶、dna连接酶1、dna连接酶i本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.构建全基因组甲基化文库的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，所述步骤(4)中的所述接头1含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列、或由如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列组成；所述步骤(5)中的所述接头2含有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列、或由如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成；优选：
3.根据权利要求1-2任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中在步骤(3)中含有DNA变性步骤；其用于纳克级别的基因组DNA，优选1ng-20ng，更优选1ng-10ng，更优选1ng-5ng，更优选1ng-3ng，最优选1ng；其中步骤(4)和(5)中磁珠的用量为0.8-2倍，优选为1-1.2倍。
4.根据权利要求1-3中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中步骤(4)和(5)中所用的连接酶选自以下一种或多种：NAD-依赖性连接酶，比如Taq DNA连接酶、丝状栖热菌(Thermus f
5.根据权利要求1～4中任意一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，所述步骤(6)中，在通过PCR扩增文库并纯化产物后，还包括质量检测的步骤：检测扩增后的产物片段长度，当产物片段长度为150bp-400bp，则得到的产物为全基因组甲基化文库；优选产物片段长度为150-300bp。
6.一种全基因组甲基化文库建库试剂盒，其用于如权利要求1～5任意一项所述的构建全基因组甲基化文库的方法；
7.一种基因组甲基化目标区域测序方法，其包括以下步骤：
8.用于构建DNA文库的接头，其包含如SEQ ID NO:1-4任一项或多项所述的核苷酸序列，或由如SEQ ID NO:1-4任一项或多项所述的核苷酸序列组成。
9.根据权利要求8所述的用于构建DNA文库的接头，其中所述文库是全基因组甲基化文库。
10.根据权利要求8所述的用于构建DNA文库的接头，其中所述文库是微量文库；优选所述文库是微量DNA全基因组甲基化文库。
...【技术特征摘要】
1.构建全基因组甲基化文库的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，所述步骤(4)中的所述接头1含有seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列、或由如seq id no:1和seq idno:2所示的核苷酸序列组成；所述步骤(5)中的所述接头2含有seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列、或由如seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列组成；优选：
3.根据权利要求1-2任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中在步骤(3)中含有dna变性步骤；其用于纳克级别的基因组dna，优选1ng-20ng，更优选1ng-10ng，更优选1ng-5ng，更优选1ng-3ng，最优选1ng；其中步骤(4)和(5)中磁珠的用量为0.8-2倍，优选为1-1.2倍。
4.根据权利要求1-3中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中步骤(4)和(5)中所用的连接酶选自以下一种或多种：nad-依赖性连接酶，比如taq dna连接酶、丝状栖热菌(thermus filiformis)dna连接酶、大肠杆菌(e.coli)dna连接酶、tth dna连接酶、水管致黑栖热菌(thermus scotoductus)dna连接酶(i和ii)、热稳定连接酶、ampligase...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭媛媛，李永君，魏闯，关晋霞，杨亚东，刘栓平，李琪，
申请(专利权)人：博尔诚北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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