【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞，具体涉及一种用于创伤修复的脂肪干细胞组合物及其制备方法和应用。
技术介绍
1、皮肤是人体第一大器官，作为人体的保护屏障，具有防护外来机械损伤、防止病原微生物和化学性物质入侵机体的重要作用。最轻度的创伤仅限于皮肤表皮层，稍重者有皮肤和皮下组织断裂，并出现伤口；严重的创伤可有肌肉、肌键、神经的断裂及骨折。轻度创伤可通过上皮再生愈合，后两者由于创伤严重，会引起正常皮肤组织的外观形态和组织病理学改变而形成瘢痕，瘢痕生长超过一定的限度，就会发生各种并发症，诸如外形的破坏及功能活动障碍等，给患者带来巨大的肉体痛苦和精神痛苦，尤其是烧伤、烫伤、严重外伤后遗留的瘢痕。
2、各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用，在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ascs)系2001年首次报道从脂肪组织分离获得，因其与骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derived stem cells，bmscs)一样具有高度增殖和自我更新能力，可在脂肪组织中分离获得大量的ascs，且能多向分化成为中胚层和非中胚层细胞，使其成为成体干细胞在再生医学应用研究的热点，被广泛应用于皮肤组织再生、软骨和骨组织再生、伤口愈合等众多研究领域。
3、在创伤修复的研究中，如何能抑制乃至消除瘢痕的产生，是现有临床医学的难题。中国专利cn
4、因此如何利用脂肪间充质干细胞（亦称脂肪干细胞）提供一种抑制乃至消除瘢痕的外用组合物成为现有技术中亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出一种用于创伤修复的脂肪干细胞组合物及其制备方法和应用，具有较好的植入受损组织，释放营养物质，促进新血管形成，调节氧化应激和诱导抗炎反应的作用，有助于创面修复，在皮肤表皮温度35-37℃之间能够转化成凝胶相，稳定成分，缓控释释放。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、本专利技术提供一种用于创伤修复的脂肪干细胞组合物的制备方法，向dmem培养基中加入胎牛血清、地塞米松、青霉素、链霉素、胶原、磁性颗粒、p物质，制备得到培养基，用于脂肪间充质干细胞的低频磁场培养，分离，获得干细胞溶液，包埋制得干细胞微球，上清液冻干获得旁分泌培养物质，与干细胞微球、羟丙基甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质酸、甘油、干细胞微球，搅拌混合均匀，制得用于创伤修复的脂肪干细胞组合物。
4、作为本专利技术的进一步改进，包括以下步骤：
5、s1. 培养基的制备：向dmem培养基中加入胎牛血清、地塞米松、青霉素、链霉素、胶原、磁性颗粒、p物质，制备得到培养基；
6、s2. 脂肪间充质干细胞的培养：将脂肪间充质干细胞复苏后加入培养基中，低频磁场培养，待细胞贴壁生长至80-90%融合后，磁铁分离磁性物质，剩余物离心，收集上清液，固体用d-hank’s液冲洗，消化，重悬于dmem培养基中，冻存，制得干细胞溶液；
7、s3. 培养液的处理：将步骤s2中的上清液冷冻干燥，制得旁分泌培养物质；
8、s4. 丝素蛋白肽支架颗粒的制备：将丝素蛋白肽和卵磷脂溶于水中，得到溶液，滴加入液体石蜡中，乳化，加入edc和nhs混合溶液，搅拌固化，离心，洗涤，干燥，制得丝素蛋白肽支架颗粒；
9、s5. 干细胞微球的制备：将干细胞溶液复苏后，加入丝素蛋白肽支架颗粒，搅拌吸附，加入海藻酸钠和卵磷脂，搅拌混合均匀，滴加入液体石蜡中，乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，离心，洗涤，干燥，制得干细胞微球；
10、s6. 温敏水凝胶的制备：将羟丙基甲基纤维素溶于热水中，冷却至室温，加入羧甲基壳聚糖、透明质酸和甘油，搅拌混合均匀，置于4℃时，加入干细胞微球和旁分泌培养物质，搅拌混合均匀，制得用于创伤修复的脂肪干细胞组合物。
11、作为本专利技术的进一步改进，步骤s1中所述培养基中胎牛血清的含量为9-11wt%，地塞米松的含量为5-15nmol/l，青霉素的含量为100-120u/ml，链霉素的含量为100-120μg/ml，胶原的含量为70-100μg/ml，磁性颗粒的含量为100-200μg/ml，p物质的含量为3-5μg/ml，所述磁性颗粒为微米级四氧化三铁。
12、作为本专利技术的进一步改进，步骤s2中所述低频磁场培养培养的时间为1-2周，所述培养的条件为36-38℃，co2浓度为3-6v/v%，所述低频磁场的频率为40-50hz，刺激时间为30-40min/d；所述消化液为含有1-2wt%胰蛋白酶、0.5-1wt%碱性蛋白酶的ph为7.5-7.7的pbs缓冲液。
13、作为本专利技术的进一步改进，步骤s4中所述丝素蛋白肽、卵磷脂、edc和nhs的质量比为15-20:0.5-1:0.1-0.2:0.15-0.25。
14、作为本专利技术的进一步改进，步骤s5中所述干细胞溶液、丝素蛋白肽支架颗粒、海藻酸钠和卵磷脂的质量比为100:12-15:17-22:1-2。
15、作为本专利技术的进一步改进，步骤s6中所述热水的温度为70-80℃，所述羟丙基甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质酸、甘油、干细胞微球和旁分泌培养物质的质量比为10-12:5-7:3-4:2-4:7-10:4-6。
16、作为本专利技术的进一步改进，具体包括以下步骤：
17、s1. 培养基的制备：向dmem培养基中加入胎牛血清、地塞米松、青霉素、链霉素、胶原、微米级四氧化三铁、p物质，制备得到培养基；
18、所述培养基中胎牛血清的含量为9-11wt%，地塞米松的含量为5-15nmol/l，青霉素的含量为100-120u/ml，链霉素的含量为100-120μg/ml，胶原的含量为70-100μg/ml，微米级四氧化三铁的含量为100-200μg/ml，p物质的含量为3-5μg/ml；
19、s2. 脂肪间充质干细胞的培养：将脂肪间充质干细胞复苏后加入培养基中，36-38℃，co2浓度为3-6v/v%，低频磁场培养1-2周，所述低频磁场的频率为40-50hz，刺激时间为30-40min/d，待细胞贴壁生长至80-90%融合后，磁铁分离磁性物质，剩余物离心，收集上清液，固体用d-hank’s液冲洗，消化，重悬于dmem培养基中，冻存，制得干细胞溶液；
20、所述消化液为含有1-2wt%胰蛋白酶、0.5-1wt%碱性蛋白酶的ph为7.5-7.7的pbs缓冲液；
21、s3. 培养液的处理：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于创伤修复的脂肪干细胞组合物的制备方法，其特征在于，向DMEM培养基中加入胎牛血清、地塞米松、青霉素、链霉素、胶原、磁性颗粒、P物质，制备得到培养基，用于脂肪间充质干细胞的低频磁场培养，分离，获得干细胞溶液，包埋制得干细胞微球，上清液冻干获得旁分泌培养物质，与干细胞微球、羟丙基甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质酸、甘油、干细胞微球，搅拌混合均匀，制得用于创伤修复的脂肪干细胞组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述培养基中胎牛血清的含量为9-11wt%，地塞米松的含量为5-15nmol/L，青霉素的含量为100-120U/mL，链霉素的含量为100-120μg/mL，胶原的含量为70-100μg/mL，磁性颗粒的含量为100-200μg/mL，P物质的含量为3-5μg/mL，所述磁性颗粒为微米级四氧化三铁。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述低频磁场培养培养的时间为1-2周，所述培养的条件为36-38℃，CO2浓度为3-6
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述丝素蛋白肽、卵磷脂、EDC和NHS的质量比为15-20:0.5-1:0.1-0.2:0.15-0.25。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述干细胞溶液、丝素蛋白肽支架颗粒、海藻酸钠和卵磷脂的质量比为100:12-15:17-22:1-2。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述热水的温度为70-80℃，所述羟丙基甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质酸、甘油、干细胞微球和旁分泌培养物质的质量比为10-12:5-7:3-4:2-4:7-10:4-6。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的用于创伤修复的脂肪干细胞组合物。
10.一种如权利要求9所述用于创伤修复的脂肪干细胞组合物在制备修复皮肤创伤的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于创伤修复的脂肪干细胞组合物的制备方法，其特征在于，向dmem培养基中加入胎牛血清、地塞米松、青霉素、链霉素、胶原、磁性颗粒、p物质，制备得到培养基，用于脂肪间充质干细胞的低频磁场培养，分离，获得干细胞溶液，包埋制得干细胞微球，上清液冻干获得旁分泌培养物质，与干细胞微球、羟丙基甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质酸、甘油、干细胞微球，搅拌混合均匀，制得用于创伤修复的脂肪干细胞组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述培养基中胎牛血清的含量为9-11wt%，地塞米松的含量为5-15nmol/l，青霉素的含量为100-120u/ml，链霉素的含量为100-120μg/ml，胶原的含量为70-100μg/ml，磁性颗粒的含量为100-200μg/ml，p物质的含量为3-5μg/ml，所述磁性颗粒为微米级四氧化三铁。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述低频磁场培养培养的时间为1-2周，所述培养的条件为36-38℃，co2浓度为3-6v/v%，所述低频磁场的频率...
【专利技术属性】
技术研发人员：王壮，雷起凤，梁玉倩，尹娜，杨俊丽，
申请(专利权)人：北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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