【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析检测，尤其涉及一种胰岛素均相检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，各种不同的糖尿病病因共同通过胰岛β细胞分泌胰岛素不足及（或）周围组织胰岛素作用不足导致血糖升高。目前糖尿病已成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的世界上第三号健康大敌，并且发病进程还在继续加快。
2、胰岛素是一种较小的球状蛋白，分子量为5.7×106d，等电点pi为5.3，可溶于稀酸溶液中，在中性条件下对热稳定，不耐碱，经过氧化或还原后均被失活。人血浆中的胰岛素主要以两种形式存在：一部分呈游离状态，一部分与血浆球蛋白结合。在正常生理条件下，胰岛β细胞每天均分泌适量的胰岛素进入血液循环中，调节糖、蛋白质和脂肪代谢胰岛素最重要的生理作用是降低血糖浓度，促进组织糖原合成和借宿葡萄糖的氧化，调节机体能量供应。当体内葡萄糖含量升高时，胰岛素生物合成和释放加快。血中葡萄糖浓度是刺激胰岛β细胞兴奋、促进胰岛素合成的信号。
3、目前胰岛素的测定方法主要有生物测定法、免疫学测定法和仪器分析测定法。生物测定法所需动物较多，需要恒温条件，数据处理繁琐，费时较长。仪器分析测定法主要有分光光度法、电泳分析法和高效液相色谱法。仪器分析测定法所需仪器设备较昂贵，操作繁琐、费时较长，不适合于临床批处理测定。免疫学测定法主要包括放射免疫测定法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。放射免疫测定法由于具有放射性，操作繁琐、耗时较长，试剂稳定期较短，限制了临床应用。酶联免疫分析法适合做批处理，但是重复性较差，单个样本处理时间较长，限
4、因此，如何提供一种检测成本低、操作步骤简单的胰岛素的检测方法，成为本领域亟需解决的技术难题。
技术实现思路
1、首先，本专利技术提供了一种胰岛素均相检测试剂盒，包括：r1缓冲液以及r2缓冲液；所述r1缓冲液中包括胰岛素特异性抗体、三羟甲基氨基甲烷（tris）、牛血清白蛋白（bsa）、葡萄糖和氧化型辅酶；所述r2缓冲液中包括tris、bsa以及葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物。
2、优选地，所述r1缓冲液中，胰岛素特异性抗体的浓度为0.001~200mg/l，tris的浓度为5~500mmol/l，bsa的浓度为0.05~5g/l，葡萄糖的浓度为0.5~1000mmol/l，氧化型辅酶的浓度为0.1~100mmol/l。
3、更优选地，所述r1缓冲液中，胰岛素特异性抗体的浓度为1~5mg/l，tris的浓度为30~80mmol/l，bsa的浓度为0.5~1.5g/l，葡萄糖的浓度为20~80mmol/l，氧化型辅酶的浓度为5~15mmol/l。
4、优选地，所述r2缓冲液中，tris的浓度为5~500mmol/l，bsa的浓度为0.05~5g/l；葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物的浓度为0.05~5mg/l。
5、更优选地，所述r2缓冲液中，tris的浓度为30~80mmol/l，bsa的浓度为0.5~1.5g/l；葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物的浓度为1~5mg/l。
6、优选地，所述氧化型辅酶为氧化型辅酶ⅰ（nad+）或氧化型辅酶ⅱ（nadp+）。
7、优选地，所述葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物是将胰岛素用有机溶剂溶解，经过活化后与葡萄糖脱氢酶溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到。
8、更优选地，所述葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物的制备方法包括：将葡萄糖脱氢酶在室温条件下溶解于tris缓冲液中，葡萄糖脱氢酶的终浓度为0.01~100mg/ml（优选为2~6mg/ml），tris的终浓度为5~1000mmol/l（优选为10~100mmol/l，更优选为10~20mmol/l），制得葡萄糖脱氢酶溶液；用有机溶剂溶解胰岛素，使得胰岛素的终浓度为0.01~100mg/ml（优选为2~6mg/ml），经过活化后与葡萄糖脱氢酶溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到。
9、优选地，所述活化采用的试剂包括edc、edc/nhs、戊二醛、高碘酸钠或硼氢化钠。
10、优选地，所述活化采用的试剂为edc/nhs。
11、优选地，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺（dmf）或二甲基亚砜（dmso）中的至少一种（优选dmf）。
12、在具体实施过程中，所述胰岛素特异性抗体可以为通常购买的商业化抗体。
13、进一步，本专利技术提供了采用上述试剂盒检测胰岛素的方法，包括：向生化分析仪中加入样品，再依次加入r1缓冲液以及r2缓冲液，测定不同时间点的340nm吸光度数值，得到样品反应速率值，然后根据校准曲线获得样品中胰岛素的浓度值。
14、优选地，所述样品为血清、血浆或全血。
15、本专利技术的检测方法为均相检测方法，该检测方法是一种竞争性反应，反应体系中与抗体结合的胰岛素与游离的胰岛素不需要经过分离，其基本反应原理如下：
16、样品中的胰岛素与偶联在葡萄糖脱氢酶上面的胰岛素对胰岛素特异性抗体的结合位点进行竞争。液相样品中的胰岛素竞争性的取代与胰岛素特异性抗体结合的葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物，并使其从胰岛素特异性抗体的结合位点上释放出来，从而恢复酶的活性。因此，样品中胰岛素浓度越高，游离的葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物就越多，从而od340nm反应速率越快，从而得到更强的信号。因此，可以通过制作校准曲线，根据校准曲线中反应速率与校准品浓度的关系式来定量样品中的胰岛素浓度。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
18、本专利技术的胰岛素均相检测方法和试剂盒具有操作简单、快速、检测结果准确、灵敏度高、重复性好、费用低等优势，对于将来临床大面积推广应用，特别是缺乏昂贵机器的中小医院具有很好的前景。
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1.一种胰岛素均相检测试剂盒，其特征在于，包括：R1缓冲液以及R2缓冲液；所述R1缓冲液中包括胰岛素特异性抗体、三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、葡萄糖和氧化型辅酶；所述R2缓冲液中包括三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白以及葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1缓冲液中，胰岛素特异性抗体的浓度为0.001~200mg/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为5~500mmol/L，牛血清白蛋白的浓度为0.05~5g/L，葡萄糖的浓度为0.5~1000mmol/L，氧化型辅酶的浓度为0.1~100mmol/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2缓冲液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为5~500mmol/L，牛血清白蛋白的浓度为0.05~5g/L；葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物的浓度为0.05~5mg/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氧化型辅酶为氧化型辅酶Ⅰ或氧化型辅酶Ⅱ。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物是将胰岛素用有机溶剂溶解，经过活
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述活化采用的试剂包括EDC、EDC/NHS、戊二醛、高碘酸钠或硼氢化钠。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述活化采用的试剂为EDC/NHS。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的至少一种。
9.采用权利要求1~8中任一项所述试剂盒检测胰岛素的方法，其特征在于，包括：向生化分析仪中加入样品，再依次加入R1缓冲液以及R2缓冲液，测定不同时间点的340nm吸光度数值，得到样品反应速率值，然后根据校准曲线获得样品中胰岛素的浓度值。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述样品为血清、血浆或全血。
...【技术特征摘要】
1.一种胰岛素均相检测试剂盒，其特征在于，包括：r1缓冲液以及r2缓冲液；所述r1缓冲液中包括胰岛素特异性抗体、三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、葡萄糖和氧化型辅酶；所述r2缓冲液中包括三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白以及葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述r1缓冲液中，胰岛素特异性抗体的浓度为0.001~200mg/l，三羟甲基氨基甲烷的浓度为5~500mmol/l，牛血清白蛋白的浓度为0.05~5g/l，葡萄糖的浓度为0.5~1000mmol/l，氧化型辅酶的浓度为0.1~100mmol/l。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述r2缓冲液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为5~500mmol/l，牛血清白蛋白的浓度为0.05~5g/l；葡萄糖脱氢酶-胰岛素偶联物的浓度为0.05~5mg/l。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氧化型辅酶为氧化型辅酶ⅰ或氧化型辅酶ⅱ...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜爱铭，
申请(专利权)人：中生北控生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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