【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种o78血清型大肠杆菌衍生的高产仿生囊泡稳定递呈h9n2亚型禽流感病毒（aiv ）ha1蛋白的制备方法及在抗h9亚型禽流感和禽大肠杆菌病中的应用。
技术介绍
1、在集约化饲养的家禽养殖场，多种病原体混合感染的现象普遍存在，造成的经济损失巨大。h9n2亚型禽流感病毒（avian influenza virus, aiv）是我国家禽中普遍流行的病原之一，单独感染时对家禽的致病性较低，通常不会导致直接死亡，但在实际生产中，许多生产损失与其直接相关。禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic e. coli, apec）作为家禽中最常见的细菌性病原体之一，常与h9n2 亚型aiv发生混合感染产生协同作用，导致家禽死亡率升高，生产性能下降以及人类食源性传播风险。
2、疫苗接种是目前防控禽流感和禽大肠杆菌病的主要策略之一。亚单位疫苗作为一种新型疫苗，通过递呈病原体的特定抗原成分，从而激发免疫反应，相比传统疫苗具有安全性更高、生产更简便等优势。然而，亚单位疫苗的免疫原性通常较弱，亟需有效的载体系统来增强其免疫效果。近年来，外膜囊泡（outer membrane vesicles，omvs）作为亚单位疫苗载体的研究逐渐受到关注。其中大肠杆菌的omvs因其易于制备、成本低廉、可调控性强，成为研究热点之一。最近的几项研究表明，通过在外膜或周质中生产异源蛋白可以靶向到omvs上。此外，通过将异源蛋白与囊泡相关蛋白进行融合表达，也可以实现这一靶向过程，因此这为以omvs为载体展示外源蛋白开辟了可能。大肠
3、传统疫苗在应对病原体多样性和变异性方面存在局限性，且抗生素滥用引发了细菌耐药性问题。apec血清型众多，其中o78为中国常见的血清型之一。然而，由于apec不同血清型之间的交叉保护效果并不理想，现有的工程化大肠杆菌omvs表达外源蛋白只能产生针对外源抗原的免疫应答。因此开发一种能够同时针对h9n2 aiv和o78血清型apec的二联疫苗，成为急需解决的科研难题和实际需求。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术通过构建o78血清型大肠杆菌缺陷菌δtola-δarad提高仿生囊泡产量，通过l-阿拉伯糖诱导及高压均质技术，实现ha1蛋白在仿生囊泡的表面递呈，并评估其作为免疫原是否能够有效保护鸡免受h9n2亚型禽流感病毒和o78血清型大肠杆菌的感染。
2、本专利技术提供的技术方案如下所示：
3、一种融合蛋白，所述融合蛋白由clya蛋白与ha1蛋白通过linker串联得到；所述clya蛋白、linker及ha1蛋白的序列如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
4、本专利技术还提供一种大肠杆菌仿生囊泡递呈h9亚型禽流感病毒ha1蛋白的制备方法，将clya与h9n2 aiv ha1蛋白通过linker串联，在囊泡供体中表达融合蛋白，利用高压均质技术，使融合蛋白clya-ha1递呈至仿生囊泡表面，得到重组仿生囊泡（bbv）；所述clya蛋白、linker及ha1蛋白的核苷酸序列针对大肠杆菌进行了密码子优化，如seq id no.1、seqid no.2和seq id no.3所示。
5、seq id no.1：
6、atgacagaaatagtagctgacaagaccgttgaggtggtgaaaaacgccatcgaaaccgcagatggtgcactcgacctgtataacaagtatctggaccaggtgattccgtggcagacctttgatgaaaccatcaaggagctgagtcgttttaaacaagaatacagccaagcggcgtctgttctggttggtgacatcaagactttgcttatggattcgcaagataagtacttcgaagcgacgcaaaccgtttatgagtggtgtggtgtcgctacccagctgttggcggcatatattctgttattcgacgagtacaacgaaaagaaagcgagcgcgcagaaagacattctgatcaaggtgctggacgacggcattaccaaattgaatgaggctcaaaagtctttgttggtttcatcccagagcttcaacaacgcgtctggaaagttgctggcgctggacagccagctgaccaatgatttcagcgaaaagtccagctatttccagagccaagtggacaaaatccgtaaagaagcctacgcaggcgcggccgcgggtgttgtagccggtccgtttggtctgatcatcagctacagcattgccgcaggtgtcgtggaaggcaagctcatcccggaactgaagaacaagctgaaatcagtccagaatttctttaccaccctgagcaataccgtgaagcaggcaaataaagatattgatgcagcgaaattaaagctcaccacagagatcgcggcgattggcgaaattaaaaccgagacggaaacgacccgtttttatgttgactacgatgacctgatgctgagcctgcttaaggaggcggctaaaaaaatgattaacacgtgcaacgagtaccagaagcgccatggtaaaaaaactctgttcgaggttccggaggtg；
7、seq id no.2：
8、ggctccggctctggtgaaggttccggc；
9、seq id no.3：
10、gacaaaatctgcattggttatcaaagcacgaacagcaccgaaaccgttgatacgctgactgagaacaacgtgccggttacacatgcgaaagaactgcttcacaccgagcacaacggcatgctgtgtgcgaccggtttgggccacccgctcatcctggatacgtgcaccattgaaggtctgatctacggcaatccgagctgcgacctgttgttgggtggacgtgaatggagctatatcgtggaaagaccatccgcggttaacggtctgtgctacccgggtaacgtggagaacctggaagagctgcgcagccttttcagttctgcgtcctcctaccaacgtatccaaatctttccggataccatctggaatgtgacgtacagcggcaccagcaaggcgtgttcggacagcttctatcgtagcatgcgttggctgacccagaaaaataacgcctacccgattcaggatgctcaatata本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白由ClyA蛋白与HA1蛋白通过Linker串联得到；所述ClyA蛋白、Linker及HA1蛋白的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.一种大肠杆菌仿生囊泡递呈H9亚型禽流感病毒HA1蛋白的制备方法，其特征在于，将ClyA与H9N2 AIV HA1蛋白通过Linker串联，在囊泡供体中表达融合蛋白，利用高压均质技术，使融合蛋白ClyA-HA1递呈至仿生囊泡表面，得到重组仿生囊泡；所述ClyA蛋白、Linker及HA1蛋白的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌仿生囊泡递呈H9亚型禽流感病毒HA1蛋白的制备方法，其特征在于，将ClyA与H9N2 AIV HA1蛋白通过Linker串联，将核糖体结合位点融合在ClyA序列N端促使融合蛋白表达，将6×his标签融合在HA1序列C端，利用T4连接酶将ClyA-HA1序列插入pBAD18-Cm载体中的EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位点之间，构建pBAD18-ClyA
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌仿生囊泡递呈H9亚型禽流感病毒HA1蛋白的制备方法，其特征在于，构建pBAD18-ClyA-HA1重组质粒的引物如SEQ ID NO.11~14所示。
5.根据权利要求2所述的大肠杆菌仿生囊泡递呈H9亚型禽流感病毒HA1蛋白的制备方法，其特征在于，所述囊泡供体为O78血清型大肠杆菌缺陷菌ΔtolA-ΔaraD；所述囊泡供体通过λ-Red同源重组技术将araD基因敲除。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌仿生囊泡递呈H9亚型禽流感病毒HA1蛋白的制备方法，其特征在于，将araD基因敲除的打靶片段引物如SEQ ID NO.5和6所示。
7.根据权利要求5所述的大肠杆菌仿生囊泡递呈H9亚型禽流感病毒HA1蛋白的制备方法，其特征在于，所述O78血清型大肠杆菌缺陷菌ΔtolA-ΔaraD的鉴定引物如SEQ ID NO.7~10所示。
8.一种重组仿生囊泡，其特征在于，由权利要求2~7所述方法制备得到。
9.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2~7所述的方法或权利要求8所述的重组仿生囊泡在制备防治H9亚型禽流感病毒和O78血清型大肠杆菌感染试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重组仿生囊泡用于抑制H9亚型禽流感病毒在鸡喉头和泄殖腔的排毒以及降低O78血清型大肠杆菌感染鸡体内的细菌载量，减轻气囊和心脏的炎症程度。
...【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白由clya蛋白与ha1蛋白通过linker串联得到；所述clya蛋白、linker及ha1蛋白的序列如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
2.一种大肠杆菌仿生囊泡递呈h9亚型禽流感病毒ha1蛋白的制备方法，其特征在于，将clya与h9n2 aiv ha1蛋白通过linker串联，在囊泡供体中表达融合蛋白，利用高压均质技术，使融合蛋白clya-ha1递呈至仿生囊泡表面，得到重组仿生囊泡；所述clya蛋白、linker及ha1蛋白的序列如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌仿生囊泡递呈h9亚型禽流感病毒ha1蛋白的制备方法，其特征在于，将clya与h9n2 aiv ha1蛋白通过linker串联，将核糖体结合位点融合在clya序列n端促使融合蛋白表达，将6×his标签融合在ha1序列c端，利用t4连接酶将clya-ha1序列插入pbad18-cm载体中的ecorⅰ和hindⅲ 酶切位点之间，构建pbad18-clya-ha1重组质粒；所述核糖体结合位点序列如seq id no.4所示。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌仿生囊泡递呈h9亚型禽流感病毒ha1蛋白的制备方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭大新，李悦，陈素娟，秦涛，印云聪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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