【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及环状rna以及制备和使用环状rna的方法。
技术介绍
1、信使rna(mrna)是一类参与蛋白质合成的单链rna。体外转录(ivt)mrna最近作为具有巨大治疗潜力的新型药物引起了广泛关注。尤其是covid-19mrna疫苗的成功使用已经证明了其体内安全性和功效。然而，mrna非疫苗疗法诸如蛋白质替代疗法中的使用受到若干因素的限制，这些因素包括mrna稳定性、其体内表达的持久性、免疫原性和表达细胞类型。
2、环状rna(circrna)已成为一种治疗剂。circrna是一类单链rna，形成3’-5’共价闭环。circrna是通过称为“反向剪接”的非典型剪接过程产生的，其中剪接体将下游外显子中的剪接供体位点与上游外显子中的剪接受体位点融合。尽管circrna一般是非编码的，但若干研究已经提供了一些circrna可被翻译成蛋白质的证据。与线性mrna不同，circrna不需要5'-帽或3'-聚(a)尾巴来保持其稳定性。此外，circrna具有mrna所不具备的有益特征，诸如降低的免疫原性和延长的翻译持续时间。由于这些原因，circrna已被探索作为治疗剂。
3、研究人员已经开发出若干种方法，在体外将线性rna前体的末端连接成闭合的环状rna。最常用的方法包括酶连接和核酶连接。酶连接介导的环化通常需要互补夹板(complementary splint)(dna或rna寡核苷酸)使rna分子的两端更靠近，并利用来自噬菌体t4的酶(诸如t4 dna连接酶、t4 rna连接酶1和t4 rna连接酶2)催化。
4、替代地，环状rna也可以通过核酶连接来制备。核酶介导的rna环化通常通过基于经修饰的i型内含子自剪接系统的置换内含子和外显子(permuted intron and exon，pie)方法来进行。i型内含子是大型自剪接核酶。天然的i型内含子不需要剪接体或其它蛋白质的帮助来进行自剪接，而是依靠镁和游离鸟苷核苷酸来起始和完成反应。这一过程导致侧接内含子的外显子的连接以及内部内含子环化，由此产生内含子circrna。先前的研究使用经修饰的i型内含子设计了pie系统，包括将i型内含子的5'半区放置到外显子的尾部，并将剩余的3'半区转移到同一外显子的头部(puttaraju等人，1992，“group i permutedintron-exon(pie)sequences self-splice to produce circular exons”，nucleicacids res 20,5357-5364；wesselhoeft等人，2018，“engineering circular rna forpotent and stable translation in eukaryotic cells”，nature communications 9,2629)。这一方法通过常规i型内含子自剪接反应实现rna环化，所述自剪接反应包括在限定的剪接位点进行两次酯交换反应。游离gtp对5'剪接位点的攻击导致pie构建体的3'端序列(5'半区内含子)的释放(第一次酯交换)。在第二次酯交换反应中，新产生的3'半区外显子的游离3'oh基团攻击3'剪接位点。由此引起circrna和3'半区内含子的释放。
5、与酶连接介导的环化相比，pie方法可用于环化较大的线性rna前体，其不需要添加额外蛋白质连接酶，而且其反应条件和纯化方法相对更容易开发和优化。pie方法合成的编码外源蛋白质的环状rna已在体外和体内得到验证，并且它们保留了低免疫原性和较长翻译持续时间的特征，由此拓宽其应用范围(wesselhoeft等人,2019,“rnacircularization diminishes immunogenicity and can extend translation durationin vivo.”mol.cell.74,508-520；qu等人,2022,“circular rna vaccines against sars-cov-2and emerging variants”,cell 185,1728-1744)。基于这些优点，pie系统成为目前研究最多且应用最广泛的rna环化方法。
6、通过pie方法在体外生成circrna需要一个侧翼为置换的i型催化内含子的3'和5'内含子的感兴趣序列的构建体。pie序列载体经单一酶切线性化后作为体外转录的模板。前体rna是通过t7聚合酶介导的标准体外转录(ivt)反应然后纯化获得的。ivt反应的产率和纯化产物的纯度需要在生产过程中优化和保证，并且它们也是核酸药物生产的技术核心。需要将经纯化的前体rna在约70℃下预变性然后快速冷却复性，然后进行后续反应以确保有效环化。在工业放大生产中可能需要特殊的预变性设备，以实现对较大反应体系的充分且均匀的加热，并确保快速准确的冷却过程。环化的最佳温度应设置为约55℃，并需在特定的缓冲体系(含2mm gtp、50mm tris hcl、10mm mgcl2、1mm dtt，ph 7.5)中进行。此外，前体rna浓度需要进行优化以实现环化。当前体rna浓度较低时可以充分环化，但在后续生产放大中反应体积呈指数级增加，对反应温度控制和反应容器选择都提出了巨大的挑战。虽然增加前体rna的浓度可以减少反应体积，从而减轻放大生产的压力，但代价是牺牲环化速度。按照既定的工艺流程，在放大生产中从线性化质粒的ivt到前体纯化需要至少两天时间，并伴随可能的rna损失。经纯化的前体rna需要特殊的变性和兼容55℃条件的反应设备进行环化，然后快速终止反应，接着进行柱色谱纯化。这些步骤至少需要两天。因此，传统工艺获得经纯化的circrna至少需要四天。在传统的两步工艺中放大环状rna的生产仍然存在技术挑战和困难。
7、需要比传统工艺更简单、更快速和更有效的核酶介导的环化工艺。
技术实现思路
1、在一个方面，本专利技术提供一种制备环状rna的方法(方法1.0)，其包括在反应溶液中提供一种模板dna(其中所述模板dna包含编码前体rna的序列)，以允许通过所述模板dna的体外转录合成前体rna，并允许所述前体rna自剪接，从而产生环状rna，其中所述模板dna的体外转录和所述前体rna的自剪接(即环化)是在相同的反应溶液中在相同的反应条件(例如，相同的反应温度)下进行。该方法可以在单一反应容器中以单一步骤进行，并且在允许前体rna自剪接之前不限于纯化前体rna的步骤。
2、在一些实施方案中，所述dna模板包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：rna聚合酶启动子、任选地5'同源臂、含有3'剪接位点二核苷酸的3'i型内含子片段、任选地5'间隔序列、插入序列、任选地3'间隔序列、含有5'剪接位点二核苷酸的5'i型内含子片段以及任选地3'同本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备环状RNA的方法，其包括在反应溶液中提供模板DNA，其中所述模板DNA包含编码前体RNA的序列，以允许通过所述模板DNA的体外转录合成所述前体RNA，并允许所述前体RNA自剪接，从而产生环状RNA，其中所述模板DNA的体外转录和所述前体RNA的自剪接是在相同反应溶液中在相同反应条件下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括在允许所述前体RNA自剪接之前纯化所述前体RNA的步骤。
3.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述DNA模板包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：RNA聚合酶启动子、任选地5'同源臂、含有3'剪接位点二核苷酸的3'I型内含子片段、任选地5'间隔序列、插入序列、任选地3'间隔序列、含有5'剪接位点二核苷酸的5'I型内含子片段以及任选地3'同源臂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述插入序列包含蛋白质编码序列，并且其中所述插入序列包含可操作地连接到所述蛋白质编码序列的IRES序列。
5.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述反应溶液包含浓度大于26mM的Mg2+。
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7.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述反应溶液包含浓度从1U/ml至5U/ml、从1U/ml至4U/ml、从1.5U/ml至3U/ml、从1.5U/ml至2.5U/ml、约1U/ml、约2U/ml或约4U/ml的焦磷酸酶。
8.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述反应溶液包含38-66mM Mg2+、任选地1-4U/ml焦磷酸酶、RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制剂、ATP、GTP、CTP、UTP、DTT和单价阳离子(Na+或K+)。
9.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述模板DNA的体外转录和所述前体RNA的环化(即，自剪接)在从37℃至55℃的温度下进行。
10.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述模板DNA的体外转录和所述前体RNA的环化(即，自剪接)在高于37℃的温度下进行，任选地其中所述模板DNA的体外转录和所述前体RNA的环化(即，自剪接)在从39℃至50℃的温度下进行。
11.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述模板DNA的体外转录和所述前体RNA的环化(即，自剪接)进行至少1小时，任选地其中所述模板DNA的体外转录和所述前体RNA的环化(即，自剪接)进行至少2.5-3小时。
12.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述方法还包括所述前体RNA合成之后去除所述DNA模板的步骤，任选地其中所述DNA模板是通过添加脱氧核糖核酸酶I，例如在37℃下持续30分钟来去除。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法还包括去除所述DNA模板的步骤之后纯化所述环状RNA的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述纯化步骤选自沉淀步骤、切向流过滤步骤和色谱步骤，以及其组合。
15.一种用于一步法环状RNA合成的反应溶液(例如，用于根据任何前述权利要求所述的方法)，所述反应溶液为包含浓度大于26mM的Mg2+、任选地焦磷酸酶(例如，1-4U/ml焦磷酸酶)、RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制剂、三磷酸核苷(例如，ATP、GTP、CTP和UTP)、还原剂(例如，DTT)和单价阳离子(例如，选自Na+、K+及其组合)的水性溶液。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种制备环状rna的方法，其包括在反应溶液中提供模板dna，其中所述模板dna包含编码前体rna的序列，以允许通过所述模板dna的体外转录合成所述前体rna，并允许所述前体rna自剪接，从而产生环状rna，其中所述模板dna的体外转录和所述前体rna的自剪接是在相同反应溶液中在相同反应条件下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括在允许所述前体rna自剪接之前纯化所述前体rna的步骤。
3.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述dna模板包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：rna聚合酶启动子、任选地5'同源臂、含有3'剪接位点二核苷酸的3'i型内含子片段、任选地5'间隔序列、插入序列、任选地3'间隔序列、含有5'剪接位点二核苷酸的5'i型内含子片段以及任选地3'同源臂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述插入序列包含蛋白质编码序列，并且其中所述插入序列包含可操作地连接到所述蛋白质编码序列的ires序列。
5.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述反应溶液包含浓度大于26mm的mg2+。
6.如任何前述方法所述的方法，其中所述反应溶液包含浓度大于35mm的mg2+，任选地其中所述溶液中的mg2+浓度是从38mm至66mm。
7.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述反应溶液包含浓度从1u/ml至5u/ml、从1u/ml至4u/ml、从1.5u/ml至3u/ml、从1.5u/ml至2.5u/ml、约1u/ml、约2u/ml或约4u/ml的焦磷酸酶。
8.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述反应溶液包含38-66mm mg2+、任选地1-4u/ml焦磷酸酶、rna聚...
【专利技术属性】
技术研发人员：杞少鋆，燕化远，郜鹏，
申请(专利权)人：苏州艾博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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