【技术实现步骤摘要】
本说明书涉及细胞制备领域，特别涉及一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用。
技术介绍
1、细胞与基因治疗（cell and gene therapy，cgt）产品已成为全球医药发展的前沿和热点，其中til细胞免疫疗法(tumor infiltrating lymphocytes, 肿瘤浸润淋巴细胞)已在实体肿瘤治疗方面显示出良好效果，目前已有til细胞药物获批上市，且有多款针对不同实体肿瘤的til细胞药物获批ind处于不同临床阶段。til细胞免疫疗法是将患者肿瘤组织中的t细胞分离出，在体外进行刺激扩增后回输到患者体内，从而扩大免疫应答，达到治疗原发或继发肿瘤的目的，其原理主要是肿瘤组织内浸润了大量t细胞，其中存在部分针对肿瘤特异性抗原的t细胞，其可以深入肿瘤组织内部特异性杀伤肿瘤。til细胞免疫疗法在实体肿瘤治疗方面显示出广阔的应用前景。
2、til细胞的活性原料主要为患者经手术切除的肿瘤组织或淋巴结，肿瘤组织或淋巴结经逐级转移后获得的肿瘤细胞悬液中含有部分处于“睡眠”状态且针对肿瘤特异性抗原的淋巴细胞，该部分细胞经体外活化和扩增为具有效应功能的t细胞后回输到患者体内，其可以深入肿瘤组织内部通过重启t细胞免疫应答信号通路从而特异性杀伤肿瘤，达到治疗原发或继发肿瘤的目的。
3、目前til细胞激活扩增工艺主要存在的缺点和不足之处如下：
4、（1）肿瘤组织处理阶段
5、传统的肿瘤组织处理方式是将肿瘤组织放置于添加无菌剪切液的一个培养皿中，通过无菌剪刀将所有肿瘤组织剪碎至无肉眼
6、（2）快速扩增阶段（rep）
7、传统的细胞激活主要是以3-6个不同健康供体来源混合且经辐照后的异源pbmc做为饲养细胞，然后按一定比例添加以激活和扩增til细胞，异源pbmc来源的饲养细胞主要缺点如下：
8、①异源供体来源的饲养细胞在激活til时会引入批次间异质性和可变性，从而可能影响til细胞在商业化生产时产品稳定性和临床治疗效果。
9、②多个异源供体来源辐照后pbmc做饲养细胞时一般用量较大（如til：饲养细胞=1：50-1：100），导致单批til生产时饲养细胞使用成本增加，且产品饲养细胞残留风险增加；
10、③大量异源健康供体pbmc需要从单采血分离获得，采购成本较高，而供体单采血需冷链运输，且一般要求48h内必须进行处理，因此对物流运输要求比较高。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种基于k562饲养细胞的til细胞制备方法及其应用。在快速扩增阶段（rep）采用单克隆化的基因改造k562细胞辐照后获得的饲养细胞进行til细胞的激活和扩增。
2、本申请提供一种基因修饰的k562细胞，所述k562细胞含有编码il-15、4-1bbl和cd86的多核苷酸。
3、本申请提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，使用上述的k562细胞培养扩增肿瘤浸润淋巴细胞。
4、本申请提供上述的k562细胞或上述的方法在肿瘤浸润淋巴细胞制备中的应用。
5、本申请带来的有益效果包括但不限于：（1）经过将肿瘤组织逐级剪切浸润方式预扩增培养获取til细胞得率提高1.5倍，且细胞活率在90%以上。（2）由于单克隆化的基因改造k562饲养细胞批次均一稳定，可保证k562饲养细胞激活和扩增后tils细胞产品的稳定性和功效。另外，基因改造k562可通过建立批量细胞库，随用随取，可大大降低单批til细胞生产时异体pbmc来源的饲养细胞使用成本，同时降低til产品中饲养细胞残留风险。此外，同样til:饲养细胞=1：25比例，基于基因改造k562 饲养细胞刺激扩增14天的til细胞扩增倍数达到1300倍以上（为pbmc饲养细胞刺激培养的til细胞扩增倍数的2.14倍），细胞活率在90%以上，til细胞表型（cd3阳性率）达到95%以上，整个工艺阶段饲养细胞残留均为阴性，效靶比在1：1、1：3和1：10时细胞杀伤效率分别为25.4%、46.8%和55.9%（与pbmc饲养细胞刺激培养的til细胞杀伤效率无明显区别），效靶比为1：10时ifn-γ分泌达689pg/ml（略高于pbmc饲养细胞刺激培养的til细胞ifn-γ分泌）。该制备方法简单、高效、有利于til细胞规模化生产。
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1.一种基因修饰的K562细胞，其特征在于，所述K562细胞含有编码IL-15、4-1BBL和CD86的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的K562细胞，其特征在于，所述K562细胞表达IL-15、4-1BBL和CD86。
3.如权利要求1所述的K562细胞，其特征在于，所述K562细胞表达膜结合型IL-15、4-1BBL和CD86。
4.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，使用如权利要求1～3任一项所述的K562细胞培养扩增肿瘤浸润淋巴细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，培养基中IL-2的浓度为2000～4000IU/ml；
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，培养时使用的培养基中含有IL-2和CD3抗体；
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于， 所述培养基中IL-2的浓度为2000～4000IU/ml，CD3抗体的浓度为20～40ng/ml。
9.如权利要求7所述的方
10.如权利要求1～3任一项所述的K562细胞或权利要求4～9任一项所述的方法在肿瘤浸润淋巴细胞制备中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基因修饰的k562细胞，其特征在于，所述k562细胞含有编码il-15、4-1bbl和cd86的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的k562细胞，其特征在于，所述k562细胞表达il-15、4-1bbl和cd86。
3.如权利要求1所述的k562细胞，其特征在于，所述k562细胞表达膜结合型il-15、4-1bbl和cd86。
4.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，使用如权利要求1～3任一项所述的k562细胞培养扩增肿瘤浸润淋巴细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
6.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵振军，栗红建，张丹，赵圆，李朝晖，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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