【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，特别是涉及一种ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法及应用。
技术介绍
1、黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis,mps)是一种常染色体隐性遗传的溶酶体贮积病，因降解黏多糖(glycosaminoglycans,gags)的水解酶发生突变，导致黏多糖不能被降解，进而在体内贮积致病，严重时可致残或致死。
2、其中ⅳa型黏多糖贮积症，又名morquio a综合征，因编码n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(galactosamine(n-acetyl)-6-sulfatase)的galns基因发生突变，导致其代谢底物硫酸软骨素(chondroitin sulfate,cs)和硫酸角质素(keratan sulfate,ks)等在体内异常贮积而致病。患儿出生时一般无异常表现，随着年龄增长，逐渐发展至严重骨骼关节异常及一系列其他脏器损伤，包括骨骼畸形、身材矮小、脊髓压迫、呼吸系统和心脏病变、视力及听力损伤、牙齿畸形等；多数患者死于心肺功能衰竭，预期寿命在30岁左右。
3、区别于其它mps，ⅳa型黏多糖贮积症患儿智力发育正常，但骨骼损伤比其他型的mps更广泛和严重。传统的小鼠模型无法复现ⅳa型黏多糖贮积症的骨骼系统表型、仅见组织学水平轻微病理改变和脚踝曲度异常；而现有大鼠模型存在死亡率较高等问题。
4、因此，亟需对ⅳa型黏多糖贮积症疾病动物模型进行改进。
技术实现思路
1、基于此，本申请一个或多个实施例提供了一种生存率较好、且疾
2、根据本申请实施例的第一方面，提供了一种ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3、获取galns p.m320r杂合子突变大鼠和galns p.m320r纯合子突变大鼠；
4、将galns p.m320r雄性杂合子突变大鼠与galns p.m320r雌性纯合子突变大鼠进行交配，构建所述ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型。
5、在其中一个实施例中，获取galns p.m320r杂合子突变大鼠的步骤，包括：
6、针对目标大鼠的galns p.m320r突变设计sgrna和donor oligo；
7、将cas9 mrna、所述sgrna和所述donor oligo转入目标大鼠的受精卵内，获取galns p.m320r突变的f0代大鼠；
8、将所述f0代大鼠与野生型大鼠交配，获得所述galns p.m320r杂合子突变大鼠。
9、在其中一个实施例中，获取所述galns p.m320r雌性纯合子突变大鼠的步骤，包括：
10、将所述galns p.m320r杂合子突变大鼠进行自交，获得所述galns p.m320r雌性纯合子。
11、在其中一个实施例中，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:1所示。
12、在其中一个实施例中，所述donor oligo的核苷酸序列如seq id no:2所示。
13、在其中一个实施例中，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如seq id no:3和seq id no:4所示的引物对大鼠模型的基因型进行鉴定。
14、在其中一个实施例中，所述鉴定的方法包括pcr和sanger测序中的一种或多种。
15、在其中一个实施例中，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如seq id no:5和seq id no:6所示的引物对大鼠模型的基因型进行鉴定。
16、在其中一个实施例中，其特征在于，所述鉴定的方法包括pcr-rflp。
17、根据本申请实施例的第二方面，提供了如上述任一项所述的构建方法构建得到的ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型在筛选治疗ⅳa型黏多糖贮积症的药物中的应用。
18、与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：
19、首先，本申请通过模拟临床患者常见的galns p.m318r突变，该大鼠模型具有较高的生存率，表现为轻度iva型黏多糖贮积症；其次，使用杂合子雄性大鼠和纯合子雌性大鼠进行杂交获得的纯合子突变大鼠，在3～4周即表现出明显骨骼系统表型的大鼠模型，与现有大鼠模型相比，和临床上经典ⅳa型黏多糖贮积症的发病时间更为接近；此外，通过选择不同的大鼠作为杂交母本，能够实现对大鼠模型的疾病表型的严重程度进行调控。综上所述，本申请构建得到的动物模型能够满足多种不同应用场景。
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1.一种ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，获取GALNS p.M320R杂合子突变大鼠的步骤，包括：
3.根据权利要求2所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，获取所述GALNS p.M320R雌性纯合子突变大鼠的步骤，包括：
4.根据权利要求2所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求2所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Donor Oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1～5任一项所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对大鼠模型的基因型进行鉴定。
7.根据权利要求6所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述鉴定
8.根据权利要求1～5任一项所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：使用核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对大鼠模型的基因型进行鉴定。
9.根据权利要求8所述的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述鉴定的方法包括PCR-RFLP。
10.如权利要求1～9任一项所述的构建方法构建得到的ⅣA型黏多糖贮积症大鼠模型在筛选治疗ⅣA型黏多糖贮积症的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，获取galns p.m320r杂合子突变大鼠的步骤，包括：
3.根据权利要求2所述的ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，获取所述galns p.m320r雌性纯合子突变大鼠的步骤，包括：
4.根据权利要求2所述的ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:1所示。
5.根据权利要求2所述的ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述donor oligo的核苷酸序列如seq id no:2所示。
6.根据权利要求1～5任一项所述的ⅳa型黏多糖贮积症大鼠模型的构建方法，其特征在...
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