【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑的生物细胞领域，尤其涉及一种基因修饰的hek293细胞及该细胞在nk细胞高效扩增培养中的应用。
技术介绍
1、nk细胞是一种具有广谱杀伤肿瘤细胞的细胞，其不同于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)限制性t细胞受体(t cell receptor，tcr)的t细胞依赖性机制。因此，使用同种异体nk细胞来治疗癌症，不会引起移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，gvhd)，这使得nk细胞在癌症治疗中展现出了巨大的潜力。
2、然而，nk细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量nk细胞非常困难。
3、现有阶段，采用外周血中富集扩增nk细胞的方法，其一，多数是借助于使用侵入性血液细胞分离、大型磁分离装置和细胞因子，这种方式培养成本高、操作繁琐、培养周期长、细胞扩增数量少等；其二，使用滋养层细胞扩增刺激nk细胞增殖，如wilms肿瘤细胞系、ebv转化的淋巴母细胞、慢性粒细胞白血病细胞系k562细胞；但这一种nk细胞扩增方法，细胞扩增速度相对较慢，且所得nk细胞的杀伤力不强。
技术实现思路
1、基于上述问题，本专利技术所要解决的问题在于提供一种基因编辑的hek293细胞，以及使用这种细胞进行nk细胞高效扩增培养的方法。
2、本专利技术提供的一种基因修饰的hek293细胞，该细胞的基因组中插入有mil-21和4-1bbl的编码基因；
3、本专利技术还提供上述hek293细胞的制备方法，包括步骤如下：
4、构建慢病毒表达质粒：将mil-21和4-1bbl的编码基因片段分别构建在慢病毒质粒上，获得慢病毒表达质粒；
5、慢病毒包装：将慢病毒表达质粒和转染试剂加入293t细胞溶液中，进行慢病毒包装，收集上清液，过滤并浓缩，获得慢病毒浓缩液；
6、基因修饰的hek293细胞的培养：将hek293细胞接种于盛有培养基的培养板的孔中，往所述培养板的孔中加入慢病毒浓缩液并于37℃、5%co2的培养箱中孵育培养，停止培养后，获得mil-21和4-1bbl基因修饰的hek293细胞。
7、较好地，还需对获得mil-21和4-1bbl基因修饰的hek293细胞进行如下处理：
8、hek293细胞的辐照处理：100gy的γ射线辐照处理mil-21和4-1bbl修饰的hek293细胞0.5h后，获得辐照处理的hek293细胞；转液氮储存，备用。
9、一实施例，所述hek293细胞的制备方法中，慢病毒包装过程，还包括如下步骤：
10、将慢病毒包膜质粒pmd2.g、慢病毒表达质粒、辅助质粒pmdlg/prre、辅助质粒prsv-rev混合，得到四质粒混合液；其中，慢病毒包膜质粒pmd2.g 、慢病毒表达质粒、辅助质粒pmdlg/prre、辅助质粒prsv-rev的质量比为1:4:3:2；
11、按照体积比1:2，往四质粒混合液中加入lipofectamine3000转染剂并混合均匀，将混合后的四质粒转入293t细胞中，得到过表达mil-21和4-1bbl的慢病毒载体溶液；
12、将慢病毒载体溶液离心，收集上清液，过滤并浓缩上清液，获得慢病毒浓缩液。
13、一实施例，所述ek293细胞的制备方法中，基因修饰的hek293细胞的培养过程，步骤如下：
14、按照每孔细胞密度 1ⅹ105 个/ml，将hek293细胞接种至培养板的孔中且每孔盛有含10%fbs的dmem培养基，于37℃、5%co2的培养箱中静置培养24h；
15、24h培养结束后，吸弃培养基废液，往所述培养板的孔中补充300µl新鲜的无血清dmem培养基，继续培养1h；
16、1h孵育培养结束后，根据moi=5，往培养板的孔中加入所述慢病毒浓缩液，继续培养6h；
17、6h孵育培养结束后，往培养板的孔中补充加入700µl含10%fbs的dmem 培养基，继续置培养72h；
18、72h培养结束后，往培养板中补充加入1ml含1ug/ml嘌呤霉素及10%fbs的dmem 培养基，继续培养24h，培养结束后，获得mil-21和4-1bbl基因修饰的hek293细胞。
19、本专利技术还提供一种使用上述hek293细胞进行nk细胞的扩增培养方法，包括如下步骤：
20、第0天，取5ⅹ106个上述辐照处理的hek293细胞及2.5ⅹ106个外周血中分离的pbmc或nk细胞，加入盛有nk细胞培养液的培养瓶，于37℃、5%co2的培养箱中静置培养；
21、第3天至第11天，每天往培养瓶中补充加入新鲜的nk细胞培养液；其中，第7天，还需要往培养瓶中补充加入上述辐照处理的hek293细胞，直至培养第11天结束，收集培养得到的nk细胞。
22、较好地，所述nk细胞培养方法中，第11天获得nk细胞后，还包括如下处理：
23、将收集的nk细胞转移至离心管中，700g离心10min，去上清；用冻存液重悬nk细胞沉淀，将得到的nk细胞悬液分装冻存管中，转存液氮，备用。
24、一实施例，所述nk细胞培养方法中，第3天至第11天，每天补充添加新鲜的nk细胞培养液的加入量，应维持细胞密度为1.0×106个/ml；其中，第7天，补充添加辐照处理的hek293细胞数量为3ⅹ107个。
25、一实施例，所述nk细胞培养方法中，所述nk细胞培养液为581培养基，在该培养基中含有终浓度5v/v％的热灭活人ab血清和终浓度200u/ml的il-2。
26、本专利技术利用mil-21和-1bbl编码基因片段，构建表达载体质粒及包装慢病毒，然后通过慢病毒感染hek293细胞的方式，使各靶蛋白可以在hek293细胞中稳定表达；再利用辐照处理的基因修饰后的hek293细胞，使其失去增殖功能，但是保留活性；将辐照处理基因修饰后的hek293细胞作为滋养层细胞，与pbmc或nk细胞混合，进行nk细胞体外扩增，并同时补充细胞因子il-2。通过检测nk细胞增殖、流式细胞术检测nk纯度、利用荧光素酶检测杀伤性等测试，结果显示，本专利技术构建的过表达mil-21和4-1bbl基因修饰的hek293细胞为稳转细胞，起到滋养层细胞作用，可以使nk细胞快速增殖生长，且nk细胞纯度高，杀伤力强。
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1.一种基因修饰的HEK293细胞，其特征在于，在该细胞的基因中插入有mIL-21和4-1BBL的编码基因。
2.根据权利要求1所述的HEK293细胞，其特征在于，所述mIL-21和4-1BBL的编码基因分别对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1或2所述HEK293细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
4.根据权利要求3所述的HEK293细胞的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
5.根据权利要求3或4所述的HEK293细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒包装步骤中，还包括如下步骤：
6.根据权利要求3或4所述的HEK293细胞的制备方法，其特征在于，所述基因修饰的HEK293细胞的培养中，包括如下步骤：
7.一种NK细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的NK细胞培养方法，其特征在于，第11天获得NK细胞后，还包括如下处理：
9.根据权利要求7所述的NK细胞培养方法，其特征在于，第3天至第11
10.根据权利要求7至9任一所述的NK细胞培养方法，其特征在于，所述NK细胞培养液为581培养基，在该培养基中含有终浓度5v/v％的热灭活人AB血清和终浓度200U/mL的IL-2。
...【技术特征摘要】
1.一种基因修饰的hek293细胞，其特征在于，在该细胞的基因中插入有mil-21和4-1bbl的编码基因。
2.根据权利要求1所述的hek293细胞，其特征在于，所述mil-21和4-1bbl的编码基因分别对应的氨基酸序列如seq id no.1和 seq id no.2所示。
3.一种如权利要求1或2所述hek293细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
4.根据权利要求3所述的hek293细胞的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
5.根据权利要求3或4所述的hek293细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒包装步骤中，还包括如下步骤：
6.根据权利要求3或4所述的hek293细胞的制备方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：马丽雅，黄璟，义水灵，
申请(专利权)人：深圳市先康达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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