【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学检测，具体涉及一种基于pda-sio2纳米粒子的催化发夹组装级联扩增的生物传感器制备方法与应用。
技术介绍
1、癌症也被称作恶性肿瘤，发病原因尚未完全了解，主要表现在细胞的异常分化和增殖，同时具有浸润性和转移性等生物学特征。死于癌症的人数占全部死亡人数的23.91％，而且，近十多年，癌症的发病率每年增长3.9％左右，癌症的死亡率每年增长2.5％左右，现如今癌症是严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一。
2、但是，美国癌症学会发布的统计数据表明，在美国，癌症的发病率和死亡率在最近的20年都呈下降的趋势。究其原因，在全球癌症发病率呈上升趋势的背景下，在美国癌症的发病率呈下降趋势，癌症早期筛查的广泛推广起到了重要作用。例如，通过乳腺钼靶等检测手段发现的乳腺癌为早期，通过治疗，五年生存率为98.8%，若确诊时为晚期，五年生存率则骤降至26.3%。因此，癌症的早期诊断在癌症的诊断和治疗中起着重要的作用；
3、在癌症细胞增殖的过程中，会由癌症细胞产生或刺激非癌症细胞产生一类标志癌症细胞存在和生长的物质，被称为癌症标志物。通过对癌症标志物的检测，可以对无实体瘤阶段的癌症进行检测。现已发现多种癌症标志物，如：表皮生长因子受体（egfr）、microrna(mirna）、循环肿瘤细胞、循环肿瘤dna、前列腺特异性抗原（psa）、癌胚抗原（cea）、人表皮生长因子受体2(her2）、肿瘤抑制因子p53、甲胎蛋白（afp）、gsh等。
4、循环肿瘤dna（circulating tumor
5、二氧化硅纳米颗粒具有制备分离简单、尺寸可控、表面积大、生物相容性高、毒性低等优点，是一类重要的纳米材料，近年来受到广泛关注。这些优越的性能使得sio2纳米颗粒及其复合材料在表面涂层、纳米复合材料、药物载体、抗菌材料等应用领域具有很强的竞争力。然而，由于sio2纳米颗粒表面缺乏官能团，在一定程度上限制了其应用。为了解决这一问题，sio2纳米颗粒的表面功能化被提出。从另一个角度来看，纯sio2纳米颗粒是一类光透明材料，不能作为荧光dna传感器的荧光猝灭材料。因此，有必要对sio2纳米颗粒进行表面修饰，从而使其具有荧光猝灭的纳米材料的能力。多巴胺（da）在碱性条件下可以氧化聚合，在基底材料表面形成聚多巴胺（pda）涂层。与其他表面改性策略相比，da自聚合具有制备方法简单、环境良好（室温）、水溶性好等优点。然而，很少有报道将dna扩增技术和多巴胺包覆的二氧化硅的结合起来用于细胞荧光成像。
6、本专利技术以pda修饰的sio2纳米颗粒为荧光猝灭剂制备荧光dna传感器。在较温和的条件下，利用pda涂层对sio2纳米粒子进行表面改性，简单合成了pda-sio2纳米粒子（pda-sio2 nps）。pda-sio2复合材料具有良好的水分散性、良好的生物相容性和较强的吸附能力。此外，pda-sio2复合材料是一种良好的猝灭荧光的纳米材料，可以将这种荧光猝灭能力归因于π-π堆积相互作用。本专利技术利用催化发夹自组装技术设计了发夹结构f-b-h1、h2，发夹dna可以吸附在pda-sio2 nps表面，由于多巴胺的荧光猝灭作用和h1发夹结构修饰的bhq-1基团与fam的fret，导致fam荧光猝灭，然而当ct-dna存在时，发夹结构打开，形成dsdna，由于螺旋结构对pda-sio2 nps的吸附能力较弱，荧光恢复。因此，提出的策略可以简单快速的检测血清中的ct-dna。
7、现有中国专利文件cn201810275117.9，公开了一种检测ca125的光电化学免疫传感器及其制备方法与应用，利用pda可以淬灭电极基底上的cdte荧光的原理，以多巴胺da自聚合沉积包裹sio2形成的sio2@pda纳米复合物为探针分子，cdte为光电活性物质，构建了光电化学免疫传感器来检测肿瘤标志物。本专利技术利用sio2@pda纳米复合物制备光电化学免疫生物传感器用于肿瘤标志物检测的方法，与传统的酶联免疫吸附以及传统的光学方法等方法相比具有操作简便、技术要求低、价格低廉且易于微型化等特点，所使用的荧光淬灭剂sio2@pda可以增加生物分子的负载量，放大信号。
8、现有中国专利文件202010450097.1，公开了一种用于铅离子检测的cha-sers生物传感器及其制备方法和应用，所述cha-sers生物传感器，是以银纳米颗粒修饰的单晶硅作为sers基底，将cha和dnazyme引入系统，从而拉近了拉曼信号分子与sers基底表面之间的距离，达到信号放大的效果。本专利技术制备的cha-sers生物传感器灵敏度高，最低检测浓度为0.42 pm，并且具有较好的选择性，对其它的重金属离子表现出良好的特异性。同时也扩大了sers生物传感器的应用范围，具有良好的应用前景。
9、上述对比文件公开了h1、h2发卡结构，与本技术方案发夹结构相似，对比文件工作原理为：在sers生物传感器中引入cha信号放大反应，在目标物pb2+存在下，pb2+特异性催化pb2+-特异性的dnazyme酶切反应，释放出的引发链rs1与固定于sers活性基底上的发卡探针h1的茎端区域序列部分杂交，形成不稳定的中间体rs1-h1，同时将h1发卡打开，h1探针裸露出可以打开发卡探针h2的序列，从而与一端标记拉曼信号分子r6g的发卡探针h2互补序列杂交，由于h1和h2的杂交能量高于h1与rs1的杂交能量，从而使h2通过链置换方式与h1杂交形成稳定的双链结构h1-h2，并且将引发链rs1释放出来，释放出来的rs1又可以引发下一轮的cha的发生，从而促使生成更多的h1-h2双链结构，从而达到信号放大的效果，实现检测灵敏度的提高。
10、凋亡和坏死的肿瘤细胞将其碎片化的dna分子释放到血液循环中进而形成的ct-dna，ct-dna存在于外周血中，可通过血浆提取，因此ct-dna获取便利,对患者是微创的。ct-dna的半衰期很短,只有114min,因此血液中的ct-dna浓度可以实时反映肿瘤的动态变化。
11、本专利技术以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于PDA-SiO2纳米粒子的催化发夹组装级联扩增的生物传感器制备方法，其特征在于，包括：将5'端修饰荧光团FAM，3'端荧光受体BHQ-1的F-B-H1/H2游离发夹DNA探针附着在PDA-SiO2纳米粒子的表面，以通过PDA-SiO2纳米粒子和发夹DNA探针的悬垂单链部分之间的范德华力组装基于PDA-SiO2纳米粒子的催化发夹CHA探针，所述F-B-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，H2如SEQ ID NO. 2所示。
2.如权利要求1所述的基于PDA-SiO2纳米粒子的催化发夹组装级联扩增的生物传感器制备方法，其特征在于：所述PDA-SiO2纳米粒子的合成方法包括：
3.如权利要求1或2所述方法制备的基于PDA-SiO2纳米粒子的催化发夹组装级联扩增的生物传感器。
4.如权利要求3所述生物传感器在CT-DNA检测中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用包括CT-DNA的荧光测定与CT-DNA的含量测定。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述CT-DNA的荧光测定具体
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：F-B-H1与H2的反应浓度为1：（0.5-2.5）。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：F-B-H1与H2为25nM，PDA-SiO2 NPs为150μg/mL。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述CT-DNA的含量测定包括：将制备的基于PDA-SiO2 NPs的CHA探针与不同浓度的靶标CT-DNA在30℃下反应15min，在F-7000荧光分光光度计上进行荧光测定；FAM的激发波长为480 nm，记录520nm处的发射荧光，以检测CT-DNA的浓度。
...【技术特征摘要】
1.一种基于pda-sio2纳米粒子的催化发夹组装级联扩增的生物传感器制备方法，其特征在于，包括：将5'端修饰荧光团fam，3'端荧光受体bhq-1的f-b-h1/h2游离发夹dna探针附着在pda-sio2纳米粒子的表面，以通过pda-sio2纳米粒子和发夹dna探针的悬垂单链部分之间的范德华力组装基于pda-sio2纳米粒子的催化发夹cha探针，所述f-b-h1的核苷酸序列如seq id no. 1所示，h2如seq id no. 2所示。
2.如权利要求1所述的基于pda-sio2纳米粒子的催化发夹组装级联扩增的生物传感器制备方法，其特征在于：所述pda-sio2纳米粒子的合成方法包括：
3.如权利要求1或2所述方法制备的基于pda-sio2纳米粒子的催化发夹组装级联扩增的生物传感器。
4.如权利要求3所述生物传感器在ct-dna检测中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用包括ct-dna的荧光测定与ct-dna的含量测定。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洲平，王显祥，伍爱民，王雪宜，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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