【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，具体涉及同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默在治疗β-血红蛋白病中的应用。
技术介绍
1、在人的发育过程中，伴随着造血位点的迁移，红细胞中血红蛋白的主要类型从胎儿血红蛋白(hbf,α2γ2)向成年型血红蛋白(hba,α2β2)发生改变。这种从γ-珠蛋白(hbg)向β-珠蛋白(hbb)的转录改变的过程被称为γ-向β-珠蛋白表达转换。hbb的突变导致的β-血红蛋白病(主要包括β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血症)，是世界上公认的最大的单基因遗传病，给公共健康带来了巨大的负担。在成年期激活hbf可以缓解β-血红蛋白病的临床症状，并成为该疾病的潜在的治疗方法。因此，对于γ-向β-珠蛋白表达转换中主要由bcl11a介导的hbg的表观沉默得到了大量的研究。以往研究已经实现了γ-向β-珠蛋白表达转换的部分逆转，理论上最高可提升hbf到约60％的水平。
2、然而，γ-向β-珠蛋白表达转换是否能够被完全逆转仍然未知。虽然在γ-向β-珠蛋白表达转换中发现了基因竞争和自主沉默现象，但是其调控机制仍然不清楚。作为超级增强子的基因座控制区(locus control region，lcr)增强珠蛋白基因表达是以形成染色质环的形式发挥调控功能，这样可使lcr与珠蛋白基因形成物理上的靠近。在珠蛋白基因表达转换中发生染色质构象的改变，而且lcr在一个时间点只能与一个珠蛋白基因启动子发生作用。γ-与β-珠蛋白基因间竞争结合lcr决定了珠蛋白基因的表达模式。很多证据显示hbg与lcr间相互作用的增强可减弱hbb与lcr间的相互作用，并
3、本专利技术通过破坏hbb与lcr间的相互作用的同时解除hbg上的表观沉默首次实现了γ-向β-珠蛋白表达转换的完全逆转。该发现为γ-向β-珠蛋白表达转换提供了重要的深入了解，为操纵该过程提供了新方法，并为β-血红蛋白病提供了新的治疗策略。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默在治疗β-血红蛋白病中的应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面提供了同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默的试剂在制备用于治疗β-血红蛋白病的药物中的应用；
4、所述同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默是通过破坏hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件来实现的。
5、进一步，所述同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默是通过对hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行突变来实现的。
6、进一步，所述突变的类型包括缺失、替换、插入、倒置、重复和/或易位突变；
7、优选地，所述缺失突变包括移除hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基；
8、优选地，所述替换突变包括将hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基替换为其它碱基；
9、优选地，所述插入突变包括在hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的任意位置插入一个或多个碱基；
10、优选地，所述倒置突变包括hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基位置的颠倒；
11、优选地，所述重复突变包括hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基的重复；
12、优选地，所述易位突变包括hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基从一个位置移动到另一位置。
13、进一步，所述缺失突变为将hbb启动子上的caccc元件突变为cac、cc、cacc、c、accc、ccc、cacccc、caaccc、cactcc、cacacattggcc、cactc、cact或caccc元件的全部缺失中的任意一种，将hbg启动子上的tgacca元件突变为tgaca、tgaa、tgac、tga、tg、cca、t、ca、a、tgatcca、tgacaaggctattgcca、tgaacca、tgaa或tgacca的全部缺失中的任意一种；
14、优选地，所述替换突变为将hbb启动子上的caccc元件突变为taccc、catcc、cactc、cacct、tatcc、tactc、tacct、cattc、catct、cactt、tattc、tatct、tactt、cattt或tattt中的任意一种，将hbg启动子上的tgacca元件突变为taacca、tgatca、tgacta或tgatta中的任意一种。
15、进一步，所述缺失突变可应用crispr-cas9基因编辑技术实现，crispr/cas9是一种基于细菌天然免疫机制开发的基因编辑技术。经简化改造的crispr系统由核酸内切酶cas9和grna(guide rna，grna)两部分组成。cas9能识别并结合基因组上的原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif，pam)并形成dna双链解旋，此时grna的crrna部分能与pam上游序列成功互补配对，cas9将激活其核酸内切酶活性，在pam上游特定位置形成双链dna断裂(double strand break，dbs)。dbs可激活细胞的dna损伤修复机制，非同源性末端结合(non-homologous end joining，nhej)或同源重组介导的修复(homology directedrepair，hdr)。nhej，即易错修复，会在修复位点引起随机插入或缺失，造成移码突变，使得基因不再表达，由此形成基因敲除。hdr，即精准修复，能借助外源引入的单链或双链dna为模板介导基因替换或插入，这种方式可以将一段dna序列精准地插入特定的基因组位点，由此完成基因敲入或替换。
16、进一步，所述替换突变是采用本领域技术人员所公知的基因编辑技术实现的，所述基因编辑技术包括但不限于：单碱基基因编辑技术、crispr-cas9基因编辑技术。在一些实施方案中，所述替换突变是采用单碱基基因编辑技术实现的，所述单碱基基因编辑技术是指能够在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术，其基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(apobec)或腺苷脱氨酶与现存cas9n(d10a)融合而形成，依赖于crispr原理使得靶点远离pam端的4-7位的单个碱基发生修改的基因编辑技术。目前，单碱基基因编辑技术包括两种：嘧啶碱基转换技术(c/g到t/a)、嘌呤碱基转换技术(a/t到g/c)。
17、进一步，所述同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默能够实现γ-向β-珠蛋白表达转换的完全逆转。
18、在本专利技术的具体实施方案中，通过突变hbb上的caccc元件和hbg上的tgacca元件同时破坏了hbb与hbg间的竞争抑制以及hbg上的表观沉默，实现了γ-向β-珠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.同时破坏HBB竞争和HBG表观沉默的试剂在制备用于治疗β-血红蛋白病的药物中的应用；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述同时破坏HBB竞争和HBG表观沉默是通过对HBB启动子上的CACCC元件和HBG启动子上的TGACCA元件进行突变来实现的。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述突变的类型包括缺失、替换、插入、倒置、重复和/或易位突变；
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缺失突变为将HBB启动子上的CACCC元件突变为CAC、CC、CACC、C、ACCC、CCC、CACCCc、CAaCCC、CACtCC、CACacattggCC、CACTC、CACT或CACCC元件的全部缺失中的任意一种，将HBG启动子上的TGACCA元件突变为TGACA、TGAA、TGAC、TGA、TG、CCA、T、CA、A、TGAtCCA、TGAcaaggctattgCCA、TGAaCCA、TGaA或TGACCA的全部缺失中的任意一种；
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述同时破坏HBB竞争和HBG表观沉默能够实
6.一种用于治疗β-血红蛋白病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-5中任一项所述的试剂；
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
8.一种用于治疗β-血红蛋白病的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含权利要求6或7所述的药物组合物。
9.一种体外非治疗目的地完全逆转γ-向β-珠蛋白表达转换的方法，其特征在于，所述方法是通过对HBB启动子上的CACCC元件和HBG启动子上的TGACCA元件进行突变来实现完全逆转γ-向β-珠蛋白表达转换；
10.一种体外非治疗目的地促进γ-珠蛋白表达、抑制β-珠蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法是通过对HBB启动子上的CACCC元件和HBG启动子上的TGACCA元件进行突变来实现的；
...【技术特征摘要】
1.同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默的试剂在制备用于治疗β-血红蛋白病的药物中的应用；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默是通过对hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行突变来实现的。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述突变的类型包括缺失、替换、插入、倒置、重复和/或易位突变；
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缺失突变为将hbb启动子上的caccc元件突变为cac、cc、cacc、c、accc、ccc、cacccc、caaccc、cactcc、cacacattggcc、cactc、cact或caccc元件的全部缺失中的任意一种，将hbg启动子上的tgacca元件突变为tgaca、tgaa、tgac、tga、tg、cca、t、ca、a、tgatcca、tgacaaggctattgcca、tgaacca、tgaa或tgacca的全部缺失中的任意一种；
【专利技术属性】
技术研发人员：刘德培，王南宇，熊敏，杨科，张祝琴，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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