【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞改造，具体涉及tcr-t细胞的制备方法及其产品。
技术介绍
1、采用体外扩增肿瘤浸润性t细胞(tumor-infiltrating t lymphocytes,tils)的过继性细胞疗法(adoptive-cell therapy,act)在临床上取得了非常显著的成绩，但因为大部分实体瘤肿瘤病人很难制备得到足量的tils细胞用于治疗，因此其应用受到极大限制。通过基因工程改造正常t细胞，使其具有靶细胞杀伤的能力显得尤为迫切。目前最主要的两种工程化t细胞是嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell,car-tcell)和转基因t细胞受体t细胞(transgenic t-cell receptor t cell,tcr-t cell).这两种工程化t细胞的区别主要如下表所示(watanabe&nishikawa,2021)：
2、 tcr-t car-t 受体结构 二聚体 单链 识别靶点 mhc和多肽复合物 细胞表面抗
3、由于tcr-t不依赖细胞表面的抗原而发挥作用，可以靶向来自细胞任何部位的蛋白，因此具有与car-t细胞不同的应用场景。目前进入临床阶段的tcr-t试验靶向实体瘤、hiv感染、cmv感染、ebv感染、血液瘤等多种疾病类型。靶点选择包含肿瘤相关抗原、肿瘤-睾丸抗原、病毒抗原、新抗原等。尽管tcr-t的应用受到人类白细胞抗原(hla)的限制，但是其靶向hla和多肽聚合物的特点使其仍然具有广泛的应用场景(shafer,kelly,&hoyos,2022)。
4、目前将tcr分子或者对其进行改造主要依赖基因载体递送技术，如慢病毒/逆转录病毒体系、腺病毒体系、转座子体系、crispr基因敲入等。病毒体系相关的基因递送技术具有制备和检测成本高、基因随机整合带来安全风险等缺陷。转座子系统介导的基因递送则面临质粒递送效率低和基因随机整合带来安全风险等问题。crispr技术介导的基因整合可以通过定点整合来降低随机整合的风险，但是其敲入过程存在基因双链断开的过程，存在染色体易位等安全问题(morgan&boyerinas,2016)。与上述技术手段相比，mrna作为非病毒载体的基因递送手段具有其他手段所不具备的优势：(1)可以通过电转或者脂质体转染等方式转染静息状态或者增殖速度低的细胞，转染效率高，方式简单，成本低；(2)不发生基因整合的过程，因此安全风险极低；(3)可以同时递送多个编码不同蛋白的mrna，实现不同靶点的组合应用。
5、根据本申请申请人的在先专利申请cn114438127a和cn114574483a的记载，与经典线性mrna相比，基于clean-pie的环状mrna制备过程非常简单，无需加帽反应、加尾反应，流程更为简单，成本更低；基于clean-pie的环状mrna除了ires和编码区外无其他外源结构，免疫原性更低。基于clean pie的环状mrna可以介导更高更持久的蛋白表达。目前已有文献报道环状mrna应用与瘤内注射治疗(yang et al.,2022)，传染病治疗(qu et al.,2022)和肿瘤疫苗(li et al.,2022)，然而基于clean pie的环状mrna是否可以将其成本低、表达时间长、免疫原性低、安全性高等优势应用与tcr-t细胞的制备和改造，仍需要验证。
6、参考文献：
7、watanabe,k.,&nishikawa,h.(2021).engineering strategies for broadapplication of tcr-t-and car-t-cell therapies.int immunol,33(11),551-562.
8、shafer,p.,kelly,l.m.,&hoyos,v.(2022).cancer therapy with tcr-engineered t cells:current strategies,challenges,and prospects.front immunol,13,835762.
9、morgan,r.a.,&boyerinas,b.(2016).genetic modification of tcells.biomedicines,4(2).
10、yang,j.,zhu,j.,sun,j.,chen,y.,du,y.,tan,y.,...zuo,c.(2022).intratumoral delivered novel circular mrna encoding cytokines for immunemodulation and cancer therapy.mol ther nucleic acids,30,184-197.
11、qu,l.,yi,z.,shen,y.,lin,l.,chen,f.,xu,y.,...wei,w.(2022).circular rnavaccines against sars-cov-2and emerging variants.cell,185(10),1728-1744.e1716.
12、li,h.,peng,k.,yang,k.,ma,w.,qi,s.,yu,x.,...yu,g.(2022).circular rnacancer v本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种TCR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括向非T细胞受体基因改造的T细胞中导入环状mRNA的步骤；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述T细胞受体靶向NY-ESO-1。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述第一环状mRNA的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.2所示的序列，或与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有所述T细胞受体活性的蛋白的序列。
4.一种TCR-T细胞的改造方法，其特征在于，所述方法包括如下(i)或(ii)所示的步骤：
5.根据权利要求4所述的改造方法，其特征在于，所述T细胞受体靶向NY-ESO-1；所述功能多肽包括IL-2、IL-12sc、CCL5、XCL1、Flt3L-Fc、GM-CSF、IFN-α和抗PD-1的纳米抗体中的任意一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的改造方法，其特征在于，所述第一环状mRNA的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.2所示的序列，或与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80％
7.一种TCR-T细胞，其特征在于，所述TCR-T细胞通过根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法或根据权利要求4～6中任一项所述的改造方法获得。
8.一种向靶细胞递送药物的方法，其特征在于，所述方法包括：使含有药物的根据权利要求7所述的TCR-T细胞与靶细胞接触；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述靶细胞为肿瘤细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将所述含有药物的根据权利要求7所述的TCR-T细胞给药于受试体。
...【技术特征摘要】
1.一种tcr-t细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括向非t细胞受体基因改造的t细胞中导入环状mrna的步骤；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述t细胞受体靶向ny-eso-1。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述第一环状mrna的核苷酸序列包含如seq id no.2所示的序列，或与seq id no.2所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有所述t细胞受体活性的蛋白的序列。
4.一种tcr-t细胞的改造方法，其特征在于，所述方法包括如下(i)或(ii)所示的步骤：
5.根据权利要求4所述的改造方法，其特征在于，所述t细胞受体靶向ny-eso-1；所述功能多肽包括il-2、il-12sc、ccl5、xcl1、flt3l-fc、gm-csf、ifn-α和抗pd-1的纳米抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨嘉丽，姜苏芩，韦理想，张本佳，王梦露，左炽健，
申请(专利权)人：广州医达健康管理科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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