【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种重组猪干扰素融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、干扰素（interferon，ifn）是一类动物机体产生的多功能分泌蛋白，涉及抗病毒、细胞生长调节和免疫激活等。干扰素具有增强自然杀伤细胞（nk细胞）、巨噬细胞和t淋巴细胞活力和抗病毒、抗肿瘤、免疫调节功能等多种生物活性，作为广谱抗病毒剂被广泛使用。干扰素在发挥作用的过程中不能直接杀伤或抑制病毒，而是通过与细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而达到抑制病毒复制的作用。
2、干扰素主要分为ⅰ、ⅱ和ⅲ型。其中iii型干扰素主要包含1fn-λ1（il-29），ifnλ-2（il-28α）和ifn-λ3（il-28β）三种，其功能性受体复合物是由il-28rα和il-10rβ（又称crf2-4）组成的异二聚体，后又发现位于ifn-λ3上游的第四种iii型干扰素ifn-λ4。猪的ⅲ型干扰素（poifn-λ）主要由ifn-λl、ifn-λ3两种亚型构成。
3、养猪业中需要大量使用外源poifn-λ来提高猪的抗病毒能力。到目前为止，人们已经通过多种外源蛋白表达系统来提高poifn-λ的产量和活性，其中包括大肠杆菌、干酪乳杆菌毕赤酵母和哺乳动物细胞。利用毕赤酵母作为宿主细胞是一个很好的选择，因为它具有真核性质、高效的分泌能力和高细胞密度的培养能力。此外，在强调控的aox1促进下，甲醇作为唯一的碳源和能源，可以进一步降低工业生产成本；其次，蛋白纯化过程简易，降低了生产成本。
4、目前，已经使用毕赤酵母对poifn-λ
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种重组猪干扰素融合蛋白及其制备方法和应用。用于解决现有的使用毕赤酵母对poifn-λ进行表达时，存在着该干扰素poifn-λ不能在毕赤酵母中富集等问题。
2、在第一方面，本专利技术提供了一种重组猪干扰素融合蛋白，融合蛋白由猪干扰素λ和蛋白c激活因子通过linker进行可操作地连接得到；其中，蛋白c激活因子的氨基酸序列如seq id no: 5所示，linker的氨基酸序列如seq id no: 7所示。
3、本专利技术中，专利技术人研究发现，将猪干扰素λ和蛋白c激活因子进行可操作地连接后，得到的融合蛋白在毕赤酵母中富集的能力显著提高。
4、在一些实施方案中，蛋白c激活因子的c端通过linker与猪干扰素λ的n端进行可操作地连接。
5、在一些实施方案中，融合蛋白选自如下任一种：a1）具有如seq id no: 1所示的氨基酸序列；a2）将如seq id no: 1所示的氨基酸序经过一个或几个氨基酸残基的变化得到的具有相同生物活性的蛋白质，其中，变化包括如下至少一种：b1）取代；b2）缺失；b3）添加。
6、本专利技术提供的上述融合蛋白可以是天然、重组或合成的活性多肽，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主（例如大肠杆菌）或真核宿主（例如酵母、高等植物）中产生的产物。
7、在第二方面，本专利技术提供了编码上述任一项重组猪干扰素融合蛋白的核酸分子。
8、在一些实施方案中，核酸分子为如下任一所示的核酸分子：1）具有如seq id no:2所示的核苷酸序列的核酸分子；2）与1）限定的核酸分子在严格条件下杂交且编码上述任一项融合蛋白的核酸分子；3）与1）或2）限定的核酸分子具有90%以上的序列同一性且编码上述任一项融合蛋白的核酸分子。
9、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
10、如本文所用，术语“在严格条件下杂交”是指两个核酸分子片段在如sambrook等的分子克隆：实验手册(1989)(冷泉巷实验室出版，纽约，美国)的“大肠杆菌中克隆基因的表达”一节里所述的标准杂交条件下互相杂交。这样的条件如在45℃的6.0×ssc中杂交，然后在50℃的2×ssc中进行洗涤的步骤。为了选择严格性，可以例如在用于低严格性的50℃下的2.0×ssc和用于高严格性50℃下的2.0×ssc之间选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，洗涤步骤中温度可在用于低严格性的约22℃的室温和用于高严格性的65℃之间变化。
11、如本文所用，术语“序列同一性”可以用肉眼或计算机软件（比如ausubel et al.eds.（2007）在current protocols in molecular biology中所述的软件程序）进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列具有一定百分比（例如90%、95%、98%或者99%）的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。
12、在第三方面，本专利技术提供了一种重组载体，其包含上述核酸分子。
13、本专利技术中的重组载体包括克隆载体和表达载体，克隆载体用于复制相关序列，表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为pohbm905bdm载体。
14、在一些实施方案中，pohbm905bdm载体中的目的基因可以包含一个或多个拷贝。
15、在一些优选的实施方案中，pohbm905bdm载体中的目的基因包含4个拷贝。
16、本专利技术中，专利技术人进一步研究发现，对目的基因进行多拷贝表达后，能进一步提高融合蛋白在毕赤酵母中的富集。
17、在第四方面，本专利技术提供了一种重组细胞，其包含上述核酸分子或上述重组载体。
18、在一些实施方案中，重组细胞的制备方法包括将上述重组载体转化至表达宿主细胞中的步骤。
19、在第五方面，本专利技术提供了一种重组猪干扰素融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：对上述重组细胞进行培养，经诱导表达，得到培养物；从培养物中分离上述任一项融合蛋白。
20、本专利技术中，培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组细胞正常生长即可。并且从培养物中分离出上述融合蛋白的方法均是本领域的常规方法。
21、在一些实施方案中，融合蛋白的制备方法中所使用的培养基是本领域内可表达蛋白质的培养基，优选bmmy培养基。
22、在第六方面，本专利技术提供了一种药物组合物，其包括上述任一项融合蛋白、上述任一项核苷酸分子、上述重组载体、上述重组细胞或上述制备方法制备得到的融合蛋白。
23、在一些实施方案中，药物组合物还包括药学上可接受的载体。
24、本专利技术中，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或溶媒，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。示例性地，药学上可接受的载体包括与药物施用相容的缓冲剂、无菌注射用水、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。每种载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组猪干扰素融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由猪干扰素λ和蛋白C激活因子通过linker进行可操作地连接得到；
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白C激活因子的C端通过linker与所述猪干扰素λ的N端进行可操作地连接。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自如下任一种：
4.编码权利要求1-3中任一项所述的重组猪干扰素融合蛋白的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下任一所示的核酸分子：
6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求4或5所述的核酸分子。
7.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求4或5所述的核酸分子或权利要求6所述的重组载体。
8.一种重组猪干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4-5中任一项所述的核苷酸分子、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或权利要求8所述的制备方法
10.权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4-5中任一项所述的核苷酸分子、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或权利要求8所述的制备方法制备得到的融合蛋白在制备预防和/或治疗猪病毒性疫病的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组猪干扰素融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由猪干扰素λ和蛋白c激活因子通过linker进行可操作地连接得到；
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白c激活因子的c端通过linker与所述猪干扰素λ的n端进行可操作地连接。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自如下任一种：
4.编码权利要求1-3中任一项所述的重组猪干扰素融合蛋白的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下任一所示的核酸分子：
6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求4或5所述的核酸分子。
7.一种...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。