【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法。具体地，本专利技术涉及一种用于制备具有改进均一性的adc的生物偶联过程。
技术介绍
1、本节中的陈述仅提供与本专利技术相关的背景信息，并不一定构成现有技术。
2、抗体药物偶联物(adc)是一种具有修饰的抗体，其中利用稳定的连接子将单克隆抗体与小分子药物连接。通过将强效的细胞毒性药物递送至表达抗原的细胞，adc理想地结合了抗体的特异性和细胞毒性药物的高效力，从而增强其靶向细胞毒性活性。与传统化疗药物相比，抗体药物偶联物仅靶向表达抗原的癌细胞，因此健康细胞受到的影响较小(pettinato,mark c.(2021)“introduction to antibody-drug conjugates.”(抗体药物偶联物简介)《抗体》(mab)(瑞士巴塞尔)10(42):42-52,joubert n,beck a,dumontet c,denevault-sabourin c.(2020)“antibody-drug conjugates:the last decade.”(抗体药物偶联物：过去十年的发展。)《药物》(pharmaceuticals)(巴塞尔)。13(9):245-275.)。在多个疾病领域，尤其是在癌症领域，adc有着广泛的潜在治疗应用，成为一种用于疾病治疗的新型靶向药物。自2000年麦罗塔(mylotarg)获批以来，迄今已有14种adc药物获得了美国食品药品管理局的批准。
3、对于adc的药物连接，使用对抗体和连接子-有效载荷(即连接子
4、已经开发出许多方法来提高adc的均一性。例如，genentech的thiomab技术就是基于通过抗体工程提高adc的均一性而开发的，通过在抗体的一级序列中引入半胱氨酸，实现位点定向的耦合来提高产品的均一性(“cysteine-based coupling:challengesandsolutions”(基于半胱氨酸的耦合：挑战与解决方案)。《生物共轭化学》(bioconjugchem.)。2021年8月18日；32(8):1525-1534.)。
5、us20210040145公开了一种14-氨基酸肽tub-tag，用于任何poi的c末端，并催化各种不同酪氨酸衍生物的加成。tub-tag技术利用这种酶，将微管蛋白-酪氨酸连接酶重新用于连接抗体的c末端的功能部分，从而均质地生成dar2型抗体偶联物。
6、然而，这些技术涉及蛋白质工程和/或酶催化，因此这些技术存在一些缺点，诸如抗体表达水平较低、免疫原性风险、纯化过程复杂和/或成本较高。同时，没有有效的化学方法用以生成具有高d6选择性的adc。
7、因此，需要开发一种能够生成具有改进的高均一性的adc的新型生物偶联过程。
技术实现思路
1、本专利技术开发了一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法。关于对抗体的位点特异性修饰，首先选择性地还原抗体的四个链间二硫键中的三个链间二硫键。通过这种方式，本专利技术提供了多种具有高均一性的adc，诸如d2型adc、d1型adc、d4型adc、d6型adc、d3型adc、d1+d6型adc、d2+d4型adc、d1+d2型双负载adc、d1+d4型双有效载荷adc、d0+d2型双有效载荷adc、d0+d1型双有效载荷adc、d6+d2型双有效载荷adc、d6+d1型双有效载荷adc、d3+d2型双有效载荷adc、d3+d1型双有效载荷adc、d1+d2型双有效载荷adc、d1+d4型双有效载荷adc或d2+d4型双有效载荷adc。与常规偶联过程相比，adc的均一性高达55％、65％、70％、80％、85％，甚至达到90％或95％。进一步地，当增加tcep与抗体的摩尔比时，该方法的还原时间成本更低。同时，该方法操作简单并且成本降低，无需抗体工程和酶工程。通过本专利技术的方法生成的具有改进均一性的adc还具有优化的安全性和有效性。
2、一方面，本专利技术提供了一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，该位点特异性修饰为该抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，该方法包括一起使用三(2-羧乙基)膦(tcep)或其盐以及过渡金属离子。
3、第二方面，本专利技术提供了一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，该位点特异性修饰为该抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，该三个链间二硫键中的两个链间二硫键位于fab区并且一个链间二硫键位于该抗体的铰链区，该方法包括一起使用tcep或其盐以及过渡金属离子。
4、第三方面，本专利技术提供了一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，该位点特异性修饰为该抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，该三个链间二硫键中的两个链间二硫键位于fab区并且一个链间二硫键位于该抗体的铰链区，该方法包括以下步骤：
5、(a)在缓冲体系中，在存在抗体的情况下，孵育tcep或其盐以及过渡金属离子，以选择性地还原该抗体内的链间二硫键，得到携带还原硫醇基团的抗体，tcep与抗体的摩尔比为3:1至15:1，可选地，tcep与抗体的摩尔比为3:1至6:1。
6、第四方面，本专利技术提供了一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括本专利技术的方法，并且还包括以下步骤：
7、(b1)引入氧化剂以选择性地再氧化来自步骤(a)的还原硫醇基团，可选地，再氧化fab区中的还原硫醇基团，优选地，去除过量的该氧化剂以纯化氧化产物；
8、(c1)引入该金属螯合剂和修饰试剂1，以与来自步骤(b1)的该还原硫醇基团发生反应，其中，该修饰试剂1为封端试剂、第一连接子-有效载荷或第一硫桥试剂，可选地，该第一硫桥试剂携带该第一连接子-有效载荷或反应性基团本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述位点特异性修饰为所述抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，所述方法包括一起使用三(2-羧乙基)膦TCEP或其盐以及过渡金属离子。
2.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述位点特异性修饰为所述抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，所述三个链间二硫键中的两个位于Fab区并且一个位于所述抗体的铰链区，所述方法包括一起使用TCEP或其盐以及过渡金属离子。
3.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述位点特异性修饰为所述抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，所述三个链间二硫键中的两个位于Fab区并且一个位于所述抗体的铰链区，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括在步骤(a)之后引入金属螯合剂。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述TCEP与所述抗体的摩尔比为3.2:1至5:1或3.5:1至4.4:1。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，孵育温度为0
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，孵育时间为3h至24h，可选地，在步骤(a)中，所述孵育时间为12h至24h，更可选地，在步骤(a)中，所述孵育时间为16h至20h，最可选地，在步骤(a)中，所述孵育时间为16h至18h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述TCEP与所述抗体的摩尔比为3:1至6:1，孵育时间为10h至24h。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述过渡金属离子与所述TCEP的摩尔比为0.1:1至30:1，可选地，所述过渡金属离子与所述TCEP的摩尔比为0.1:1至20:1，更可选地，所述过渡金属离子与所述TCEP的摩尔比为0.5:1至8:1。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系选自由以下各项组成的组：MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、BES缓冲液、HEPES缓冲液、DIPSO缓冲液、MOBS缓冲液、MOPSO缓冲液、TES缓冲液、ACES缓冲液、TAPSO缓冲液、PBS、PB、乙酸盐缓冲液、BTP缓冲液、HEPPSO缓冲液、POPSO缓冲液、EPPS缓冲液或Tris缓冲液；可选地，所述缓冲体系选自由以下各项组成的组：MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、MOPS缓冲液、BES缓冲液、HEPES缓冲液、DIPSO缓冲液、MOBS缓冲液、MOPSO缓冲液、TES缓冲液、ACES缓冲液或TAPSO缓冲液。
11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系的pH值为5.5至8，优选地，所述缓冲体系的pH值为5.8至7.4，更优选地，所述缓冲体系的pH值为6.7至7.4。
12.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系的浓度为10mM至100mM、20mM至80mM或20mM至40mM。
13.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述过渡金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+或其组合，可选地，所述过渡金属离子为Zn2+。
14.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括权利要求3至13所述的方法，并且还包括以下步骤：
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述第一硫桥试剂和所述第二硫桥试剂独立地含有允许对所述硫醇基团进行重新桥接的至少两个取代基。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一硫桥试剂和所述第二硫桥试剂各自独立地选自由以下各项组成的组：
18.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述反应性基团各自独立地含有叠氮基和/或二苯并环辛炔DBCO。
19.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述TCEP与所述抗体的摩尔比为4:1至15:1，所述孵育时间为1h至16h，可选地，在步骤(a)中，所述TCEP与所述抗体的摩尔比为4:1至10:1，所述孵育时间为4h至8h。
20.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述过渡金属离子与所述抗体的摩尔比为1:1至10:1或1:1至2:1。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述位点特异性修饰为所述抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，所述方法包括一起使用三(2-羧乙基)膦tcep或其盐以及过渡金属离子。
2.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述位点特异性修饰为所述抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，所述三个链间二硫键中的两个位于fab区并且一个位于所述抗体的铰链区，所述方法包括一起使用tcep或其盐以及过渡金属离子。
3.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述位点特异性修饰为所述抗体内的三个链间二硫键被选择性地还原，所述三个链间二硫键中的两个位于fab区并且一个位于所述抗体的铰链区，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括在步骤(a)之后引入金属螯合剂。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述tcep与所述抗体的摩尔比为3.2:1至5:1或3.5:1至4.4:1。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，孵育温度为0℃至37℃，可选地，在步骤(a)中，所述孵育温度为0℃至25℃，更可选地，在步骤(a)中，所述孵育温度为0℃至15℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，孵育时间为3h至24h，可选地，在步骤(a)中，所述孵育时间为12h至24h，更可选地，在步骤(a)中，所述孵育时间为16h至20h，最可选地，在步骤(a)中，所述孵育时间为16h至18h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述tcep与所述抗体的摩尔比为3:1至6:1，孵育时间为10h至24h。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述过渡金属离子与所述tcep的摩尔比为0.1:1至30:1，可选地，所述过渡金属离子与所述tcep的摩尔比为0.1:1至20:1，更可选地，所述过渡金属离子与所述tcep的摩尔比为0.5:1至8:1。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系选自由以下各项组成的组：mes缓冲液、bis-tris缓冲液、pipes缓冲液、mops缓冲液、bes缓冲液、hepes缓冲液、dipso缓冲液、mobs缓冲液、mopso缓冲液、tes缓冲液、aces缓冲液、tapso缓冲液、pbs、pb、乙酸盐缓冲液、btp缓冲液、heppso缓冲液、popso缓冲液、epps缓冲液或tris缓冲液；可选地，所述缓冲体系选自由以下各项组成的组：mes缓冲液、bis-tris缓冲液、mops缓冲液、bes缓冲液、hepes缓冲液、dipso缓冲液、mobs缓冲液、mopso缓冲液、tes缓冲液、aces缓冲液或tapso缓冲液。
11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系的ph值为5.5至8，优选地，所述缓冲体系的ph值为5.8至7.4，更优选地，所述缓冲体系的ph值为6.7至7.4。
12.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系的浓度为10mm至100mm、20mm至80mm或20mm至40mm。
13.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述过渡金属离子选自由以下各项组成的组：zn2+、cd2+、hg2+、ni2+、co2+或其组合，可选地，所述过渡金属离子为zn2+。
14.一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括权利要求3至13所述的方法，并且还包括以下步骤：
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述第一硫桥试剂和所述第二硫桥试剂独立地含有允许对所述硫醇基团进行重新桥接的至少两个取代基。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一硫桥试剂和所述第二硫桥试剂各自独立地选自由以下各项组成的组：
18.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述反应性基团各自独立地含有叠氮基和/或二苯并环辛炔dbco。
19.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述tcep与所述抗体的摩尔比为4:1至15:1，所述孵育时间为1h至16h，可选地，在步骤(a)中，所述tcep与所述抗体的摩尔比为4:1至10:1，所述孵育时间为4h至8h。
20.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述过渡金属离子与所述抗体的摩尔比为1:1至10:1或1:1至2:1。
21.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤(b...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴丽丽，吉傲，贺文旭，
申请(专利权)人：苏州佰睿壹生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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