【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种优化的柠檬酸菌株构建方法及其应用。
技术介绍
1、柠檬酸是一种十分重要的有机酸，是天然的防腐剂和食品添加剂，广泛应用于工业、食品和化妆品行业。主要通过微生物发酵法生产，其主要的生产菌株包括酵母和黑曲霉。黑曲霉是柠檬酸产业中最具竞争力的工业菌株，黑曲霉生产的柠檬酸全球年产量达200万吨，产值超过20亿美元，并以每年5％的速度递增。
2、由于黑曲霉的遗传改造难度较大，早期的研究主要集中在发酵工艺的优化以提高黑曲霉的产量，如碳源、氮源、ph等发酵条件的不断优化。近年来，随着代谢工程的发展以及黑曲霉遗传操作工具的不断开发，通过基因工程改造提高柠檬酸产量的报道也陆续出现，改造的靶点包括增加其底物乙酰辅酶a的供应、增加柠檬酸的外排、增加呼吸链调节等等。这些遗传改造在不同程度上提高了黑曲霉柠檬酸的产量。然而，随着全球市场对于柠檬酸需求的日益增长，如何发现新的改造靶点，构建高效的黑曲霉工程菌株提高柠檬酸的产量，进一步降低生产成本，是本领域需要解决的问题。
技术实现思路
1、为克服现有技术中存在的不足，本专利技术基于对黑曲霉m202菌株的基因组数据挖掘，发现4个蛋白的失活可以提高黑曲霉柠檬酸的产量，进一步分析发现，这4个蛋白的编码基因属于一个功能未知的基因簇，而该基因簇的失活也可促进柠檬酸的生产，显著提高菌株的产酸水平；此外，生产菌株中的柠檬酸转运蛋白cexa活性增强，导致柠檬酸外排强化，进一步提高柠檬酸的产量。因此，本专利技术的首要目的是提供一种内源
2、本专利技术的目的是提供一种柠檬酸生产菌株的构建方法。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、在本专利技术的第一方面，提供一种优化的柠檬酸生产菌株构建方法，包括使用一种内源活性多肽在微生物中发酵生产柠檬酸，所述多肽为：
5、(a)氨基酸序列如seq id no:1至seq id no:4任一项所示；或
6、(b)与(a)所述多肽氨基酸序列具有98％以上同源性且来源于黑曲霉与(a)所述多肽具有相同活性。
7、优选地，所述内源活性多肽的氨基酸序列如seq id no:1-4任一项所示。
8、在本专利技术的一个方面，(a)或(b)中的一种内源活性多肽的活性减弱或完全去除。
9、在本专利技术的一个方面，所述柠檬酸生产菌株被修饰：所述柠檬酸生产菌株1)使得内源活性多肽的活性减弱或完全去除，其中所述内源活性多肽为
10、(a)氨基酸序列如seq id no:1-4任一项所示；或
11、(b)与(a)所述多肽氨基酸序列具有98％以上同源性且来源于黑曲霉与(a)所述多肽具有相同活性；
12、或者，
13、2)使得一种基因簇失活，所述基因簇为：
14、(a)核苷酸序列如seq id no:5所示；或
15、(b)与(a)所述核苷酸序列具有98％以上同源性且来源于黑曲霉。
16、优选地，所述内源性多肽的活性减弱或完全去除可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除多肽的编码基因；编码基因突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mrna稳定性减弱或编码的蛋白的结构不稳定。
17、在优选的实施方式中，使得基因编码序列发生移码突变、错义突变、缺失、起始密码子改变等。
18、进一步优选地，所述柠檬酸生产菌株中的内源活性多肽相对于未改性的内源活性多肽活性减弱，是指所述内源活性多肽的编码基因的转录、表达降低至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或完全消失；或者所述内源活性多肽的活性降低至少30％、优选至少40％，更优选至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或完全消失。
19、更进一步地，所述柠檬酸生产菌株中的柠檬酸转运蛋白活性增强。优选地，所述柠檬酸转运蛋白为氨基酸序列如seq id no:6所示的多肽。
20、优选地，所述柠檬酸生产菌株包括但不限于黑曲霉(aspergilusniger)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、米曲霉(aspergillusoryzae)、产黄青霉(penicilliumchrysogenum)、里氏木霉(trichodermareesei)、玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)或嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)菌株中的任一种，优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉或里氏木霉，最优选黑曲霉。
21、在本专利技术的一个方面，所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法包括通过遗传修饰：
22、1)使得内源活性多肽的活性减弱或完全去除，其中所述内源活性多肽为(a)氨基酸序列如seq id no:1-4任一项所示；或
23、(b)与(a)所述多肽氨基酸序列具有98％以上同源性且来源于黑曲霉与(a)所述多肽具有相同活性；
24、或者，
25、2)使得一种基因簇失活，所述基因簇为：
26、(a)核苷酸序列如seq id no:5所示；或
27、(b)与(a)所述核苷酸序列具有98％以上同源性且来源于黑曲霉。
28、优选地，所述内源性多肽的活性减弱或完全去除可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除多肽的编码基因；编码基因突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mrna稳定性减弱或编码的蛋白的结构不稳定。
29、在优选的实施方式中，使得基因编码序列发生移码突变、错义突变、缺失、起始密码子改变等。
30、进一步优选地，上述优化的柠檬酸生产菌株构建方法中，所述柠檬酸生产菌株中的内源活性多肽相对于未改性的蛋白活性减弱，是指所述内源活性多肽的编码基因的转录、表达降低至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或完全消失；或者所述内源活性多肽的活性降低至少30％、优选至少40％，更优选至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或完全消失。
31、更进一步地，所述柠檬酸生产菌株中的柠檬酸转运蛋白活性增强。
32、优选地，所述柠檬酸转运蛋白为氨基酸序列如seq id no:6所示的多肽。
33、优选地，所述柠檬酸生产菌株包括但不限于黑曲霉(aspergilusniger)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、米曲霉(asperg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，包括使用一种内源活性多肽在微生物中发酵生产柠檬酸，所述多肽为：
2.根据权利要求1所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，所述柠檬酸生产菌株被修饰：
3.根据权利要求2所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，所述内源性多肽的活性减弱或完全去除可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除多肽的编码基因；编码基因突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或编码的蛋白的结构不稳定。
4.根据权利要求2所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，所述柠檬酸生产菌株中的柠檬酸转运蛋白活性增强；并且，所述柠檬酸转运蛋白为氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示的多肽。
5.根据权利要求2所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，所述柠檬酸生产菌株为黑曲霉(Aspergilusniger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、产黄青霉(Pen
6.通过权利要求1-5任一项的所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法获得的柠檬酸生产菌株在柠檬酸生产中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，包括使用一种内源活性多肽在微生物中发酵生产柠檬酸，所述多肽为：
2.根据权利要求1所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，所述柠檬酸生产菌株被修饰：
3.根据权利要求2所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，所述内源性多肽的活性减弱或完全去除可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除多肽的编码基因；编码基因突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mrna稳定性减弱或编码的蛋白的结构不稳定。
4.根据权利要求2所述的优化的柠檬酸生产菌株构建方法，其特征在于，所述柠檬酸生产菌株中的柠檬酸转运蛋白活性增强...
【专利技术属性】
技术研发人员：于清，周爱华，郝夕祥，颜红娟，苏晓宾，王红，张立立，张国红，
申请(专利权)人：山东柠檬生化有限公司，
类型：发明
国别省市：
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