【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，尤其是涉及一种人类单倍体滋养层干细胞的制备方法。
技术介绍
1、人类滋养层细胞在胚胎发育的过程中分化形成胎盘器官，并负责母体和胎儿之间的物质运输、营养传递及免疫屏障，所以其在胚胎发育的过程中不可或缺。很多先天的基因突变会引起胎盘发育缺陷，进而引起先兆性流产及孕期子痫等严重疾病，因此对滋养层谱系进行遗传学筛选可研究胎盘发育的关键调控基因，从而深入了解胎盘相关疾病的致病机制。由于早期胎盘样本的获得存在伦理等限制因素，在体外诱导获得可模拟滋养层谱系分化的干细胞就尤为关键，而传统的滋养层干细胞为二倍体细胞，对研究基因功能或者隐性遗传表型极不方便。单倍体细胞由于只有一套染色体，其基因突变后可快速得到纯合子突变的细胞，其相较于二倍体细胞在基因研究中具有得天独厚的优势，因此本专利技术拟在体外建立单倍体滋养层干细胞(haitscs)，这是一类只有一套基因组的滋养层干细胞，该干细胞将为胎盘发育的遗传学筛选研究提供高效的便利工具。然而，由于单倍体干细胞在正常培养过程中倾向于自发二倍体化，从而丧失了单倍体的优势。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种人类单倍体滋养层干细胞的制备方法。
2、本专利技术采用的技术方案是：人类tsc培养液，以dmem/f12为基础培养基，添加0.1mmβ-me、0.2％ fbs、0.5％青链霉素、0.3％ bsa、1％ its添加剂、1.5mg/ml l-抗坏血酸、50ng/ml人egf蛋白、2mm chir99021、
3、一种人类单倍体滋养层干细胞的制备方法，将单倍体胚胎干细胞置于人类滋养层干细胞培养体系中培养，培养后流式分选单倍体细胞中itga6阳性的细胞，重新置于人类滋养层干细胞培养体系中培养，得到人类单倍体滋养层干细胞；
4、其中，人类滋养层干细胞培养体系中包括人类tsc培养液。
5、优选地，具体步骤如下：
6、步骤一：将单倍体胚胎干细胞置入人类tsc培养液中驯化培养5-7天；
7、步骤二：当培养体系中tsc克隆占据总体细胞的50％以上后，通过流式分选方法将既是单倍体又表达tsc分子标志物itga6的细胞分选出来，再次接种到人类tsc培养液中，培养2-3天，得到人类单倍体滋养层干细胞；
8、步骤三：haitscs在培养过程中，每三天传代一次，每隔15-20天经过一次流式分选，维持单倍体比例。
9、优选地，步骤一中，将单倍体胚胎干细胞日常培养于人类esc培养液中，培养条件为温度37℃，5％的co2，20％的o2；
10、其中，人类esc的培养液以knockout dmem为基础培养基，添加体积份数20％的kosr、2mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺溶液、0.5％青链霉素、0.1mmβ-me和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。
11、人类单倍体滋养层干细胞的制备方法制备得到的人类单倍体滋养层干细胞。
12、一种人类单倍体胎盘类器官的制备方法，将人类单倍体滋养层干细胞置入类器官培养液中，分化得到人类单倍体胎盘类器官。
13、优选地，使用人类单倍体滋养层干细胞，当细胞汇合度达到80％时用tryple消化，以1×104的起始细胞量混匀于100μl的75％的matirgel基底膜基质中，以每30μl的体系将细胞滴于24孔板的中央，室温静置2min，置于37℃培养倒置30min，将500μl类器官培养液加入24孔中，诱导6天后得到人类单倍体胎盘类器官；
14、优选地，类器官培养液以advanced dmem/f12为基础，添加1×n2supplement、1×b27 supplement minus vitamin a、100ug/ml primocin、1.25mm n-乙酰-l-半胱氨酸、2mml-谷氨酰胺、500nm a83-01、1.5μm chir99021、2μm y-27632、50ng/ml rhegf、50ng/mlrhhgf、80ng/ml rhr-spondin1、100ng/ml rhfgf2和2.5μm prostaglandin e2。
15、人类单倍体胎盘类器官的制备方法制备得到的人类单倍体胎盘类器官；
16、优选地，tscs分子标志物cdh1阳性的细胞位于类器官外层，sts分子标志物cgb及sdc1阳性的细胞位于类器官内层。
17、人类单倍体滋养层干细胞分化方法，将人类单倍体滋养层干细胞向sts分化或向evts分化；
18、优选地，将人类单倍体滋养层干细胞置入sts分化的培养液中分化，得到具有sts特异性分子标志物的细胞团；
19、或者，将人类单倍体滋养层干细胞置入evts分化的培养液中分化，得到具有evts特异性分子标志物的细胞团；
20、其中，sts分化的培养液以dmem/f12为基础，添加0.1mm 2-巯基乙醇，0.5％青链霉素，0.3％ bsa，1％ its添加剂，2.5μm y27632，2μm forskolin和4％kosr；
21、evts分化培养液以dmem/f12为基础，添加0.1mm 2-巯基乙醇，0.5％青链霉素，0.3％ bsa，1％ its添加剂，100ng/ml nrg1，7.5μm a83-01,2.5μm y27632和4％ kosr。
22、人类单倍体滋养层干细胞和/或人类单倍体胎盘类器官在药物靶点研究和遗传研究中的应用。
23、本专利技术具有的优点和积极效果是：提供一种快速高效的制备人类单倍体滋养层干细胞的方法，进步一的还能够构建得到人类单倍体胎盘类器官；该细胞体系与二倍体tscs在分子生物学及细胞生物学功能上极为相近，能够用于模拟体内疾病模型，并具有单倍体的遗传学筛选优势；为遗传疾病及药物的靶点探究提供了两种及其有利的实验工具。
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1.人类TSC培养液，其特征在于：以DMEM/F12为基础培养基，添加0.1mMβ-ME、0.2％FBS、0.5％青链霉素、0.3％BSA、1％ITS添加剂、1.5mg/mlL-抗坏血酸、50ng/mL人EGF蛋白、2mMCHIR99021、0.5mM A83-01、1mM SB431542、0.8mM VPA和5mM Y-27632。
2.一种人类单倍体滋养层干细胞的制备方法，其特征在于：将单倍体胚胎干细胞置于人类滋养层干细胞培养体系中培养，培养后流式分选单倍体细胞中ITGA6阳性的细胞，重新置于人类滋养层干细胞培养体系中培养，得到人类单倍体滋养层干细胞；
3.根据权利要求1所述的人类单倍体滋养层干细胞的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的人类单倍体滋养层干细胞的制备方法，其特征在于：步骤一中，将单倍体胚胎干细胞日常培养于人类ESC培养液中，培养条件为温度37℃，5％的CO2，20％的O2；
5.权利要求2-4中任一所述的人类单倍体滋养层干细胞的制备方法制备得到的人类单倍体滋养层干细胞。
6.
7.根据权利要求6所述的人类单倍体胎盘类器官的制备方法，其特征在于：使用人类单倍体滋养层干细胞，当细胞汇合度达到80％时用Tryple消化，以1×104的起始细胞量混匀于100μL的75％的Matirgel基底膜基质中，以每30μL的体系将细胞滴于24孔板的中央，室温静置2min，置于37℃培养倒置30min，将500μL类器官培养液加入24孔中，诱导6天后得到人类单倍体胎盘类器官；
8.权利要求6或7所述的人类单倍体胎盘类器官的制备方法制备得到的人类单倍体胎盘类器官；
9.权利要求5所述的人类单倍体滋养层干细胞分化方法，其特征在于：将人类单倍体滋养层干细胞向STs分化或向EVTs分化；
10.权利要求5所述的人类单倍体滋养层干细胞和/或权利要求8所述的人类单倍体胎盘类器官在药物靶点研究和遗传研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.人类tsc培养液，其特征在于：以dmem/f12为基础培养基，添加0.1mmβ-me、0.2％fbs、0.5％青链霉素、0.3％bsa、1％its添加剂、1.5mg/mll-抗坏血酸、50ng/ml人egf蛋白、2mmchir99021、0.5mm a83-01、1mm sb431542、0.8mm vpa和5mm y-27632。
2.一种人类单倍体滋养层干细胞的制备方法，其特征在于：将单倍体胚胎干细胞置于人类滋养层干细胞培养体系中培养，培养后流式分选单倍体细胞中itga6阳性的细胞，重新置于人类滋养层干细胞培养体系中培养，得到人类单倍体滋养层干细胞；
3.根据权利要求1所述的人类单倍体滋养层干细胞的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的人类单倍体滋养层干细胞的制备方法，其特征在于：步骤一中，将单倍体胚胎干细胞日常培养于人类esc培养液中，培养条件为温度37℃，5％的co2，20％的o2；
5.权利要求2-4中任一所述的人类单倍体滋养层干细胞的制备方法制备得到...
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