【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，尤其是指一种肝素水解酶突变体及其重组表达的方法。
技术介绍
1、肝素是一种天然的糖胺聚糖，主要存在于动物的肝脏和肺组织中。肝素具有抗凝血作用，能够与凝血酶和抗凝血酶结合，从而阻止血液凝结。肝素还具有抗炎和抗肿瘤的作用，可以调节免疫系统的功能，在生物体内发挥着重要的生理功能，包括细胞信号传导、细胞黏附、组织修复等。
2、细菌来源的肝素水解酶是内切-β-葡萄糖醛酸酶，属于糖苷水解酶家族79。这种酶通常具有高度特异性和活性，可以选择性地水解肝素分子中葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖之间的β-1,4-糖苷键，从而产生特定长度的肝素片段。这些细菌来源的肝素水解酶具有广泛的应用价值。肝素水解酶还可以用于肝素的修饰和改造，通过切割肝素链，改变肝素的生物活性和药理特性，从而开发出具有更好疗效的肝素类药物，肝素水解酶在癌细胞中过表达，与血管生成，炎症和增加的转移潜能有关，是一种重要的潜在抗癌药物目标。
3、然而，目前报道的细菌来源肝素水解酶种类较少，且缺乏高效表达的方法。cn108841739a公开了一种利用毕赤酵母表达系统，异源表达细菌来源肝素水解酶的重组菌，但其对肝素水解酶酶活的提升并不明显，不利于工业化生产。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种肝素水解酶突变体及其重组表达的方法，将来源于亚马逊铬菌(chromobacterium amazonense)的肝素水解酶，经过修饰和突变后，在大肠杆菌中异源表达，使用镍柱对产物进行纯化。通过该
2、本专利技术的第一个目的是提供一种肝素水解酶突变体，所述肝素水解酶突变体对氨基酸序列如seq id no.1所示的肝素水解酶进行以下任一种改造：
3、将第37位的甘氨酸突变为苏氨酸；
4、将第145位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
5、将第145位天冬酰胺突变为天冬氨酸；
6、将第37位的甘氨酸突变为苏氨酸并将第145位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
7、将第37位的甘氨酸突变为苏氨酸并将第145位天冬酰胺突变为天冬氨酸；
8、将第37位的甘氨酸突变为苏氨酸并将第281位缬氨酸突变为赖氨酸；
9、将第37位的甘氨酸突变为苏氨酸、将145位天冬酰胺突变为天冬氨酸并将第281位缬氨酸突变为赖氨酸。
10、进一步地，所述肝素水解酶来源于亚马逊铬菌。
11、进一步地，所述肝素水解酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12、本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述肝素水解酶突变体的基因。
13、本专利技术的第三个目的是提供一种包含上述基因的重组表达载体。
14、本专利技术的第四个目的是提供一种包含上述肝素水解酶突变体、上述基因或上述重组表达载体的宿主细胞。
15、本专利技术的第五个目的是提供一种表达肝素水解酶的重组工程菌，以大肠杆菌为出发菌株，表达上述肝素水解酶突变体，并在所述肝素水解酶突变体的n端添加促溶标签。
16、进一步地，所述促溶标签为trxa标签或组氨酸标签。
17、本专利技术的第六个目的是提供包含上述重组工程菌的微生物制剂。
18、本专利技术的第七个目的是提供一种肝素水解酶，由上述重组工程菌或上述微生物制剂表达得到。
19、进一步地，所述肝素水解酶以肝素钠、硫酸软骨素a、透明质酸或肝素前体为底物。
20、优选地，所述肝素水解酶以肝素钠为底物。
21、优选地，所述肝素水解酶的最适温度为45℃，最适ph值为5.0。
22、本专利技术的有益效果：
23、本专利技术将来源于亚马逊铬菌的肝素水解酶，针对部分位点进行突变并添加促溶标签，将得到的突变体在大肠杆菌中异源表达。利用诱导发酵生产的方法，将重组菌添加至含有底物的体系中发酵生产肝素水解酶，再利用镍柱对产物进行纯化，能够快速生产肝素水解酶，表达水平高，培养条件简单，且得到的肝素水解酶产物表达量高，酶学性质稳定，酶活大幅提升。
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1.一种肝素水解酶突变体，其特征在于，所述肝素水解酶突变体对氨基酸序列如SEQID NO.1所示的肝素水解酶进行以下任一种改造：
2.根据权利要求1所述的肝素水解酶突变体，其特征在于：所述肝素水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种编码权利要求1所述肝素水解酶突变体的基因。
4.一种包含权利要求3所述基因的重组表达载体。
5.一种包含权利要求1或2所述肝素水解酶突变体、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞。
6.一种表达肝素水解酶的重组工程菌，其特征在于：以大肠杆菌为出发菌株，表达如权利要求1所述的肝素水解酶突变体，并在所述肝素水解酶突变体的N端添加促溶标签。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于：所述促溶标签为TrxA标签或组氨酸标签。
8.包含权利要求6或7所述重组工程菌的微生物制剂。
9.一种肝素水解酶，其特征在于：由权利要求6所述的重组工程菌或权利要求8所述的微生物制剂表达得到。
10.根据权利要求9所述的肝素水解酶，
...【技术特征摘要】
1.一种肝素水解酶突变体，其特征在于，所述肝素水解酶突变体对氨基酸序列如seqid no.1所示的肝素水解酶进行以下任一种改造：
2.根据权利要求1所述的肝素水解酶突变体，其特征在于：所述肝素水解酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种编码权利要求1所述肝素水解酶突变体的基因。
4.一种包含权利要求3所述基因的重组表达载体。
5.一种包含权利要求1或2所述肝素水解酶突变体、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞。
6.一种表达肝素水解酶的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：康振，杨凤玲，王阳，胥睿睿，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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