本发明专利技术属于体外检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR技术检测猴痘病毒的核酸组合、试剂盒及方法。本发明专利技术的检测试剂包括RPA冻干试剂和CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂；RPA冻干试剂包括：RPA恒温扩增试剂、BufferA、前引物、后引物、混合冻干保护剂；CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂包括：Cas12a、gRNA、ssDNA报告分子、Buffer 2.1、混合冻干保护剂。混合冻干保护剂的组成根据检测体系的组成及检测的具体方法进行了优化。本发明专利技术解决了猴痘病毒的RPA/CRISPR检测试剂的常温保存和运输难题，具有操作简便、检测快速、灵敏度高以及适合现场和大规模筛查等特点，为大规模筛查提供了高效、准确的解决方案，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外检测，具体涉及一种基于crispr技术检测猴痘病毒的核酸组合、试剂盒及方法。
技术介绍
1、猴痘病毒(mpox virus,mpxv)是一种双链dna病毒，与天花和牛痘病毒同属于痘病毒科正痘病毒属。其可通过接触体液、皮肤或粘膜伤口、呼吸道飞沫、污染物体传播，食用未煮熟的感染动物肉制品也会增加感染风险。虽然mpxv患者常出现皮肤病变，但是单纯疱疹病毒、传染性软疣病毒、和各种细菌性皮肤感染等也可引起相似皮肤病变。因此需要可靠的实验室诊断方法来鉴别猴痘感染。现有免疫学、分子生物学、微生物学等方法对于鉴别mpxv与其他正痘病毒，以及诊断猴痘急性感染的价值仍然有限，不能独立用于mpxv诊断。
2、重组酶聚合酶扩增(rpa)在即时检测(poct)领域发挥着重要作用。虽然rpa已被用于检测mpxv，具有良好的灵敏度，但非特异性产物的问题不可忽视。利用crispr(clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeats)特性，向导rna(guide rna,grna)与cas蛋白紧密结合，从而激活cas蛋白的精准剪切目标dna或rna序列，因此rpa与crispr相结合，同时保证了检测过程的快速高效和准确。
3、但是，现有的方法需要开盖并转移部分扩增产物，存在气溶胶污染的风险。同时核酸检测试剂不仅需要在-20℃条件下保存，且运输或使用过程中反复冻融会降低其检测性能。因此，开发一种可在常温下稳定、不开盖的检测试剂和方法至关重要。
>技术实现思路1、针对上述问题，本专利技术提供一种基于crispr技术检测猴痘病毒的核酸组合、试剂盒及方法。
2、一种猴痘病毒一锅式荧光检测试剂，它包括rpa冻干试剂和/或crispr/cas12a检测体系冻干试剂；
3、所述rpa冻干试剂是由rpa恒温扩增体系制成的冻干试剂，所述rpa恒温扩增体系包括如下组分：
4、rpa恒温扩增试剂1个/20-25μl、
5、buffera48-60％v/v、
6、前引物0.04-0.05μm、
7、后引物0.04-0.05μm、
8、混合冻干保护剂20-25％v/v；
9、所述crispr/cas12a检测体系冻干试剂是由crispr/cas12a检测体系制成的冻干试剂，所述crispr/cas12a检测体系包括如下组分：
10、cas12a 0.2-0.33μm、
11、grna 0.2-0.33μm、
12、ssdna报告分子1.2-3μm、
13、buffer 2.18.0-13.3％v/v、
14、混合冻干保护剂16.0-26.7％v/v；
15、其中，所述混合冻干保护剂包括如下组分：
16、聚乙二醇10-20％w/v、
17、海藻糖4-15％w/v、
18、蔗糖20-32％w/v、
19、甘露醇15-30％w/v。
20、优选的，所述rpa恒温扩增体系包括如下组分：
21、rpa恒温扩增试剂1个/25μl、
22、buffera 60％v/v、
23、前引物0.04μm、
24、后引物0.04μm、
25、混合冻干保护剂20.0％v/v；
26、所述crispr/cas12a检测体系包括如下组分：
27、cas12a 0.25μm、
28、grna 0.25μm、
29、ssdna报告分子1.5μm、
30、buffer 2.110％v/v、
31、混合冻干保护剂20％v/v；
32、其中，所述混合冻干保护剂包括如下组分：
33、聚乙二醇20％w/v、
34、海藻糖15％w/v、
35、蔗糖32％w/v、
36、甘露醇30％w/v。
37、一种猴痘病毒一锅式试纸条检测试剂，它包括rpa冻干试剂和/或crispr/cas12a检测体系冻干试剂；
38、所述rpa冻干试剂是由rpa恒温扩增体系制成的冻干试剂，所述rpa恒温扩增体系包括如下组分：
39、rpa恒温扩增试剂1个/20-25μl、
40、buffera48-60％v/v、
41、前引物0.04-0.05μm、
42、后引物0.04-0.05μm、
43、混合冻干保护剂20-25％v/v；
44、所述crispr/cas12a检测体系冻干试剂是由crispr/cas12a检测体系制成的冻干试剂，所述crispr/cas12a检测体系包括如下组分：
45、cas12a 0.2-0.33μm、
46、grna 0.2-0.33μm、
47、ssdna报告分子1.2-3μm、
48、buffer 2.18.0-13.3％v/v、
49、混合冻干保护剂16.0-26.7％v/v；
50、其中，所述混合冻干保护剂包括如下组分：
51、聚乙二醇4-16％w/v、
52、海藻糖2-20％w/v、
53、甘露醇2-20％w/v。
54、优选的，所述rpa恒温扩增体系包括如下组分：
55、rpa恒温扩增试剂1个/25μl、
56、buffera60％v/v、
57、前引物0.04μm、
58、后引物0.04μm、
59、混合冻干保护剂20％v/v；
60、所述crispr/cas12a检测体系包括如下组分：
61、cas12a 0.25μm、
62、grna 0.25μm、
63、ssdna报告分子1.5μm、
64、buffer 2.110％v/v、
65、混合冻干保护剂20％v/v；
66、其中，所述混合冻干保护剂包括如下组分：
67、聚乙二醇16％w/v、
68、海藻糖20％w/v、
69、甘露醇20％w/v。
70、优选的，所述前引物包括核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2所示的引物中的至少一种；
71、所述后引物包括核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4所示的引物中的至少一种；
72、所述grna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
73、优选的，所述ssdna报告分子为修饰有荧光基团和淬灭基团的单链dna报告分子。
74、本专利技术还提供上述的检测试剂在制备猴痘病毒检测试剂盒中的用途。
75、本专利技术还本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猴痘病毒一锅式荧光检测试剂，其特征在于：它包括RPA冻干试剂和/或CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂；
2.按照权利要求1所述的猴痘病毒一锅式荧光检测试剂，其特征在于：
3.一种猴痘病毒一锅式试纸条检测试剂，其特征在于：它包括RPA冻干试剂和/或CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂；
4.按照权利要求3所述的猴痘病毒一锅式试纸条检测试剂，其特征在于：所述RPA恒温扩增体系包括如下组分：
5.按照权利要求1-4任一项所述的检测试剂，其特征在于：所述前引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物中的至少一种；
6.按照权利要求1-4任一项所述的检测试剂，其特征在于：所述ssDNA报告分子为修饰有荧光基团和淬灭基团的单链DNA报告分子。
7.权利要求1-6任一项所述的检测试剂在制备猴痘病毒检测试剂盒中的用途。
8.一种猴痘病毒检测试剂盒，其特征在于，包括：BufferB和权利要求1-6任一项所述的检测试剂。
9.一种应用权利要求8所述的猴痘病毒检测试剂盒进行非诊断目的的猴痘病毒检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.按照权利要求9所述的猴痘病毒检测试剂盒进行非诊断目的的猴痘病毒检测的方法，其特征在于：步骤1中，将复溶RPA冻干试剂的溶液加入反应管，将复溶CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂的溶液加入所述反应管的反应管盖中；步骤3中，通过瞬时离心操作将复溶CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂的溶液加入所述反应管。
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【技术特征摘要】
1.一种猴痘病毒一锅式荧光检测试剂，其特征在于：它包括rpa冻干试剂和/或crispr/cas12a检测体系冻干试剂；
2.按照权利要求1所述的猴痘病毒一锅式荧光检测试剂，其特征在于：
3.一种猴痘病毒一锅式试纸条检测试剂，其特征在于：它包括rpa冻干试剂和/或crispr/cas12a检测体系冻干试剂；
4.按照权利要求3所述的猴痘病毒一锅式试纸条检测试剂，其特征在于：所述rpa恒温扩增体系包括如下组分：
5.按照权利要求1-4任一项所述的检测试剂，其特征在于：所述前引物包括核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2所示的引物中的至少一种；
6.按照权利要求1-4任一项所述的检测试剂，其特征在于：所述ssdna报告分...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘珊，李雪，
申请(专利权)人：四川省医学科学院·四川省人民医院，
类型：发明
国别省市：
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