【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及原生质体制备，具体涉及一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法。
技术介绍
1、大葱作为一种广泛种植的植物，不仅是日常饮食中不可或缺的调味品，还富含多种有益健康的化合物。在分子育种技术不断进步的今天，大葱的基因研究已经取得了不少显著的成果，包括与类黄酮生物合成相关的af4cl基因、调控分蘖的afmax1基因以及与蜡质合成相关的afcer2-like1基因等，尽管这些基因已被克隆并进行了初步的功能分析，但因为缺乏稳定的遗传转化体系，大葱基因组功能分析仍面临挑战。为了克服这一难题，建立有效的同源表达系统至关重要。
2、原生质体作为一种重要的实验材料，在多个生物学领域发挥着关键作用。它们在研究蛋白质的功能、细胞信号转导、基因表达调控、细胞生物学过程以及多组学的综合分析[等方面都有着不可忽视的应用价值。尤其在crispr/cas9介导的基因组编辑效率评估中发挥着关键作用，在某些物种中还可以获得具有所需性状的再生植株，从而加速植物遗传改良和种子培育。目前，仍有许多物种的原生质体分离方法没有建立。并且，高效的原生质体系统仍然具有挑战性，因为不同的细胞壁成分需要特定的优化。原生质体制备常采用酶法解，而酶的组分和条件是影响原生质体分离和活性的最关键因素。在众多因素中，酶溶液的组成和ph值、酶解温度、速度和持续时间、不同富集处理、预制溶液的性质都会影响得到的原生质体的产量和活性。
3、原生质体瞬时转化和表达系统在现代分子生物学分析中发挥着重要作用，如亚细胞定位、蛋白质相互作用和转录因子活性检测。目前植物原生质
4、大葱原生质体的制备来没有一套有效的分离和瞬时转化方案。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，本专利技术是通过以下技术方案来实现的。
2、一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，该方法包括以下步骤：
3、1)大葱叶片的培养：
4、选取“章丘大梧桐”大葱品种的种子，将其种植在营养土和蛭石以3:1的质量比混合而成的培养基中，提供23℃的恒温和12小时的交替光照与黑暗周期，挑选生长20天的幼苗，采摘其新叶作为提取原生质体材料；
5、2)大葱叶片原生质体的分离与纯化：
6、配置具有不同浓度纤维素酶、离析酶、甘露醇的酶解液；使用不同的酶解液将大葱叶片酶解不同的时间，以分离大葱叶片中的原生质体；对原生质体进行提纯；
7、3)确定大葱叶片原生质体的产量和活力：
8、使用双室血球计数板在荧光显微镜下进行原生质体计数，计算原生质体的产量和活力；
9、4)确定最优酶解条件：
10、根据步骤3)中的数据，确定酶解液中最佳的纤维素酶、离析酶和甘露醇浓度，并确定最佳酶解时间；
11、5)peg介导的原生质体转化：
12、将含有gfp基因的植物表达载体pal902-gfp的质粒dna采用peg介导法转化至最优酶解条件下分离的大葱叶片原生质体；在荧光显微镜下检测转染原生质体中gfp的整合情况，所述gfp为绿色荧光蛋白，所述peg为聚乙二醇。
13、优选的，所述步骤2)中：
14、酶解液包括以下成分：20mmol/l kcl、20mmol/l mes、10mmol/l cacl2、1.0g/lbsa、纤维素酶、离析酶和甘露醇，所述mes为4-吗啉乙磺酸，其ph值为5.8，所述bsa为牛血清白蛋白溶液；
15、使用ddh2o对大葱叶片进行冲洗后用吸水纸擦拭并置于培养皿中晾干；将晾干的大葱叶片切割为宽度0.5～1.0mm的碎片；秤取0.5g的碎片与10ml酶解液混合；将酶解液和碎片的混合物置于26℃的黑暗环境中，在0.5h的真空处理后，50r/min摇晃4～10h，使大葱叶片中的原生质体释放；
16、酶解结束后，将混合液通过70μm孔径的细胞过滤器过滤，过滤后的液体收集到50ml的圆底离心管中，向过滤后的原生质体悬浮液加入等体积的预冷w5溶液，100rcf离心3min，弃上清，向所得沉淀中加入5ml w5溶液重悬原生质体，冰中避光静置30min，弃上清，将沉淀在1ml mmg溶液中重悬。
17、优选的，所述w5溶液包括4mmol/l mes、154mmol/l nacl、125mmol/l cacl2和5mmol/l kcl，w5溶液的ph值为5.7；所述mmg溶液包括0.4mol/l甘露醇，15mmol/l mgcl2和4mmol/l mes。
18、优选的，所述步骤3)中，每100μl原生质体重悬液采用1μl的0.02％的fda溶液染色，黑暗中孵育5min，取20μl的混合液，利用血球计数板进行原生质体的计数，将发出绿色荧光的原生质体计为有活力。
19、优选的，所述步骤3)中，原生质体的产量、活力的计算公式如下：
20、原生质体产量(g-1)＝计数板大方格内的原生质体数量×104/酶解材料的质量(g)；
21、原生质体活力(％)＝(发出绿色荧光的原生质体数/原生质体总数)×100％。
22、优选的，酶解液中最佳的纤维素和离析酶浓度确定方法如下：
23、步骤2)中，设置正交试验组，所有试验组具有相同的甘露醇浓度和酶解时间，正交实验组的两个影响因素为纤维素酶和离析酶的浓度，纤维素酶的测试浓度为5g/l、10g/l和15g/l，离析酶的测试浓度为3g/l、5g/l和7g/l，以此设置9个对照试验；
24、统计各对照试验中原生质体的产量和活力，确定纤维素酶和离析酶的最佳浓度。
25、优选的，酶解液中最佳的甘露醇浓度和最佳酶解时间的确定方法如下：
26、步骤2)中，设置对照实验组，在最佳的纤维素酶和离析酶的浓度下，控制酶解时间不变，将甘露醇的浓度分别设为0.3，0.4，0.5，0.6mol/l，统计各对照试验中原生质体的产量和活力，确定甘露醇的最佳浓度；
27、步骤2)中，设置对照实验组，在最佳的纤维素酶、离析酶和甘露醇的浓度下，将酶解时间分别设为4、6、8、10h，统计各对照试验中原生质体的产量和活力，确定最佳酶解时间。
28、优选的，所述步骤5)中，扩增植物表达载体pal902-gfp，提纯纯化质粒dna，将20μg质粒dna与200ul制备好的原生质体重悬液在2ml圆底离心管中混合；随后加入200ulpeg溶液，将圆底离心管倒置制成悬浮液；室温静置20min，加入1ml预冷w5溶液洗涤，100rcf离心2min并弃上清；再次加入1ml w5溶液重悬，随后将其置于35mm细胞培养皿中培养，24℃黑暗孵育20h，在荧光显微镜下检测转染原生质体中gfp的整合情况。
29、优选的，采用大肠杆菌db3.1菌株本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤2)中：
3.根据权利要求2所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述W5溶液包括4mmol/L MES、154mmol/L NaCl、125mmol/L CaCl2和5mmol/L KCl，W5溶液的pH值为5.7；所述MMG溶液包括0.4mol/L甘露醇，15mmol/L MgCl2和4mmol/L MES。
4.根据权利要求3所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤3)中，每100μL原生质体重悬液采用1μL的0.02％的FDA溶液染色，黑暗中孵育5min，取20μL的混合液，利用血球计数板进行原生质体的计数，将发出绿色荧光的原生质体计为有活力。
5.根据权利要求4所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤3)中，原生质体的产量、活力的计算公式如下：
6.根据权利要求5所述的一
7.根据权利要求6所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，酶解液中最佳的甘露醇浓度和最佳酶解时间的确定方法如下：
8.根据权利要求7所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤5)中，扩增植物表达载体pAL902-GFP，提纯纯化质粒DNA，将20μg质粒DNA与200ul制备好的原生质体重悬液在2mL圆底离心管中混合；随后加入200ulPEG溶液，将圆底离心管倒置制成悬浮液；室温静置20min，加入1mL预冷W5溶液洗涤，100rcf离心2min并弃上清；再次加入1mL W5溶液重悬，随后将其置于35mm细胞培养皿中培养，24℃黑暗孵育20h，在荧光显微镜下检测转染原生质体中GFP的整合情况。
9.根据权利要求8所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，采用大肠杆菌DB3.1菌株对植物表达载体pAL902-GFP进行扩增，然后提取纯化质粒DNA，采用电泳技术对质粒DNA的纯度和浓度进行测定，确保其OD260/OD280比值介于1.8至2.0之间，浓度达到1μg/μL，并在-20℃条件下保存。
...【技术特征摘要】
1.一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤2)中：
3.根据权利要求2所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述w5溶液包括4mmol/l mes、154mmol/l nacl、125mmol/l cacl2和5mmol/l kcl，w5溶液的ph值为5.7；所述mmg溶液包括0.4mol/l甘露醇，15mmol/l mgcl2和4mmol/l mes。
4.根据权利要求3所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤3)中，每100μl原生质体重悬液采用1μl的0.02％的fda溶液染色，黑暗中孵育5min，取20μl的混合液，利用血球计数板进行原生质体的计数，将发出绿色荧光的原生质体计为有活力。
5.根据权利要求4所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤3)中，原生质体的产量、活力的计算公式如下：
6.根据权利要求5所述的一种大葱叶片原生质体的分离及瞬时转化方法，其特征在于，酶解...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕丙盛，王丹，张遥，刘银，张忠华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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