【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子标记辅助育种，具体涉及鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的分子标记、方法、引物对、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、甜瓜(cucumis melo l.)为葫芦科甜瓜属一年蔓生草本植物，在我国及世界范围内广泛栽培，是世界上重要的经济作物。甜瓜种子的形态指标包括种子的形状、大小、光洁度等，种子的大小(主要指种子的长度和宽度)是影响产量形成、抗逆能力、果实品质的重要因素。通常较大的种子能够贮藏更多的营养物质和内源激素，有利于种子的萌发和幼苗的生长，形成健壮植株，进而提高果实品质和产量；小种子由于本身体积小、重量轻，在繁殖和自然传播方面具有更多的优势；甜瓜种子大小的丰富变异，是自然选择和人工选择的共同结果。挖掘薄皮甜瓜花瓣大小关键主效位点，将其应用于种质资源筛选和分子育种过程具有十分重要的意义。
2、indel分子标记是由于染色体序列上存在碱基的缺失和插入形成的一种多态性分子标记，该类标记在基因组中分布广泛，操作简便，结果易于观察，且在相同物种的不同种质资源中具有普遍适用性。因此，挖掘能够应用于薄皮甜瓜种子大小性状鉴定的indel分子标记，并将其应用于甜瓜种质资源筛选和分子育种过程具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了将分子标记应用于不同种子大小的薄皮甜瓜种质资源的筛选和基因聚合，获得与薄皮甜瓜种子大小紧密连锁的染色体区段及分子标记，进而更快捷地和更准确地在薄皮甜瓜苗期对其种子大小进行鉴定。
2、本专利技术提供一种鉴定薄皮甜瓜种子大小
3、本专利技术提供一种扩增鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的分子标记的引物对，所述引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
4、本专利技术提供一种鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
5、本专利技术提供一种上述分子标记、上述的引物对或上述的试剂盒在鉴定薄皮甜瓜种子大小性状中的应用。
6、本专利技术提供一种上述分子标记、上述的引物对或上述的试剂盒在对薄皮甜瓜种子大小性状的辅助鉴定、辅助育种以及筛选中的应用。
7、进一步地限定，大种子性状的种子长度范围为8.16mm-5.20mm，种子宽度范围为：3.64mm-2.65mm，所述小种子性状的种子长度范围为4.76mm-3.15mm，种子宽度范围为：2.06mm-1.72mm。
8、本专利技术提供一种鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的方法，所述的方法如下：
9、步骤1：提取待检测薄皮甜瓜基因组dna；
10、步骤2：以步骤1获得的dna为模板，利用权利要求2所述的引物对进行pcr扩增，获得pcr产物判断薄皮甜瓜种子大小性状。
11、进一步地限定，步骤1中pcr反应体系为：上下游引物各1μl，引物浓度为2pm，dna模板2μl，dna模板浓度为30ng/μl，10×pcr buffer 1μl，dntp 0.15μl，dntp浓度为10mm，taq酶0.1μl，taq酶浓度为5u/μl，无菌去离子水6.75μl；pcr反应程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
12、进一步地限定，步骤2中若扩增产物包含194bp片段，则判定为大种子类型；若扩增产物包含184bp片段，则判定为小种子类型。
13、进一步地限定，大种子性状的种子长度范围为8.16mm-5.20mm，种子宽度范围为：3.64mm-2.65mm，所述小种子性状的种子长度范围为4.76mm-3.15mm，种子宽度范围为：2.06mm-1.72mm。
14、有益效果：本专利技术前期通过构建以大种子(薄皮甜瓜栽培种)和小种子(薄皮甜瓜野生种)甜瓜为亲本的遗传群体，利用基因组重测序和bsa-seq(bulked segregationanalysis)技术获得与薄皮甜瓜种子大小性状紧密连锁的染色体区段，通过在遗传群体中进行一年两季表型鉴定和qtl(quantitative trait loci)分析，获得稳定的主效定位区间，将其命名为cmss2.1，在该主效染色体区段内开发indel分子标记，该标记位于薄皮甜瓜种子大小性状关键位点cmss2.1定位区间内，春秋两季获得了一个共同包含的区间，约为1.43mb，与种子大小(种子长度和种子宽度)性状紧密连锁。通过分子标记辅助选择的方法，在薄皮甜瓜苗期提取待测样品基因组dna即可对薄皮甜瓜种子大小进行分子标记辅助选择，提高育种的准确性和效率。该分子标记可应用于薄皮甜瓜分子育种，为薄皮甜瓜种子大小分子鉴定提供了高效分子育种工具。
15、本专利技术利用亲本重测序数据开发和获得的与薄皮甜瓜种子大小性状紧密连锁的分子标记设计引物对。由于不同甜瓜材料中该分子标记片段存在的短序列插入和缺失的多态性，通过获得的引物对对甜瓜幼苗基因组dna进行pcr扩增，利用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测pcr产物片段大小，可以对薄皮甜瓜种子大小进行苗期分子鉴定。该鉴定方法在苗期提取待测薄皮甜瓜样本的基因组dna即可实现薄皮甜瓜种子大小的鉴定，操作简便，鉴定的准确度及效率高，为薄皮甜瓜种子大小分子标记辅助选择育种提供了行之有效的育种工具及技术。
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1.一种鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种扩增鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.一种鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。
4.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在鉴定薄皮甜瓜种子大小性状中的应用。
5.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在对薄皮甜瓜种子大小性状的辅助鉴定、辅助育种以及筛选中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，大种子性状的种子长度范围为8.16mm-5.20mm，种子宽度范围为：3.64mm-2.65mm，所述小种子性状的种子长度范围为4.76mm-3.15mm，种子宽度范围为：2.06mm-1.72mm。
7.一种鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的方法，其特征在于，所述的方法如下：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1中PCR反应体系为：上下游引物各1μL，引物浓度为2pM，DNA模板2μL，DNA模板浓度为30ng/μL，10×PCR Buffer 1μL，dNTP 0.15μL，dNTP浓度为10mM，Taq酶0.1μL，Taq酶浓度为5U/μL，无菌去离子水6.75μL；PCR反应程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2中若扩增产物包含194bp片段，则判定为大种子类型；若扩增产物包含184bp片段，则判定为小种子类型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，大种子性状的种子长度范围为8.16mm-5.20mm，种子宽度范围为：3.64mm-2.65mm，所述小种子性状的种子长度范围为4.76mm-3.15mm，种子宽度范围为：2.06mm-1.72mm。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为seq idno.1或seq id no.2所示。
2.一种扩增鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
3.一种鉴定薄皮甜瓜种子大小性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。
4.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在鉴定薄皮甜瓜种子大小性状中的应用。
5.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在对薄皮甜瓜种子大小性状的辅助鉴定、辅助育种以及筛选中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，大种子性状的种子长度范围为8.16mm-5.20mm，种子宽度范围为：3.64mm-2.65mm，所述小种子性状的种子长度范围为4.76mm-3.15mm，种子宽度范围为：2.06mm-1.72mm。
7.一种鉴定薄...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘识，栾非时，方旭锋，高鹏，王学征，刘宏宇，朱子成，马鸿艳，杜黎黎，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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