【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于mirna检测，涉及一锅法实时荧光定量pcr检测mirna的引物组及方法。
技术介绍
1、microrna（微小核糖核酸）是一类长度在20-23个核苷酸(nt)左右的内源性非编码小分子单链rna，在进化过程中高度保守，能通过与靶基因mrna特异性的碱基互补配对，引起靶基因mrna的降解或者抑制其翻译，广泛地负调控靶基因的表达。自1993年被发现以来，已在人、动物、植物和病毒中发现了上万种mirna，不止在在组织细胞中发现mirna，在体液当中，包括血清、血浆、尿液等也广泛存在，以游离的 mirna或细胞内囊泡包裹的mirna等形式存在。mirna的异常表达将会导致生理的异常和疾病的产生，因此，对定量检测组织或细胞样本中mirna方法的深入研究将有助于人们进一步了解mirna与疾病发生发展的关系，为疾病的早期诊断提供新的思路。
2、成熟mirna片段较小，一般只有20-23个nt，没有poly(a)尾巴，家族成员间通常只有一两个碱基的差别，并且在细胞中的表达水平普遍较低，这些特性给mirna定量检测方法的建立带来了困难和挑战。尽管如此，科学家还是研究出了多种mirna检测方法，如northern blotting法、微阵列法、测序法、实时荧光定量pcr法等。
3、目前对于mirna的定量技术最成熟、使用最广泛的是实时荧光定量pcr技术。所谓的实时荧光定量pcr就是通过对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量pcr反应中，引入一种荧光
4、因为mirna序列较短，不能够直接进行qpcr反应，所以一般在对mirna序列逆转录的同时进行延长。目前用于识别并合成mirna第一链的方法都需要对microrna进行先逆转录得到延长的cdna，然后再进行qpcr定量，过程繁琐，耗时长，增加实验员的工作量，而且实验过程中多次开盖，增加了实验污染的风险。
技术实现思路
1、针对以上技术问题，本专利技术提供了一锅法实时荧光定量pcr检测mirna的引物组及方法，操作过程简单、特异性强。
2、本专利技术为实现技术目的采用的技术方案为：
3、本专利技术提供了一锅法实时荧光定量pcr检测mirna的引物组，包括特异性茎环引物lp，特异性linker引物、通用上游引物f、通用下游引物r以及特异性探针p，其中：
4、所述特异性茎环引物lp为茎环结构，一部分是非特异性的通用序列，一部分是与目的mirna序列3’端互补配对的特异性序列，长度在10~12 bp；
5、所述特异性linker引物，一部分是非特异性的通用序列，一部分是与目的mirna序列5’端一致的特异性序列，长度在10~12 bp；
6、所述通用上游引物f和通用下游引物r分别来自所述特异性linker引物和特异性茎环引物lp上的通用序列部分；
7、所述特异性探针p为修饰探针，长度在13~18bp，5’端进行荧光基团修饰，3’端进行淬灭基团修饰。
8、优选地，所述特异性linker引物的3’端可以不修饰，或者进行磷酸化修饰或c3spacer修饰，以提高成熟体mirna和前体mirna扩增的特异性。
9、优选地，所述特异性探针p的5’端采用cy5修饰，3’端采用mgb修饰。
10、优选地，根据需要也可以对特异性探针p中某些碱基进行lna修饰，a/g/c/t四种碱基均可修饰，既可以满足实验需要，也可以提高反应特异性。不论选择哪种修饰，所述特异性探针p的tm值应设计在65~75℃，更优选在约70℃。
11、本专利技术还提供了一锅法实时荧光定量pcr检测mirna的方法，通过上述引物组实现，包括：
12、1）使特异性茎环引物lp和目的mirna在反转录酶作用下反转录得到cdna第一链，之后对反转录酶灭活的同时激活热启动taq酶；
13、2）使特异性linker引物和步骤1）得到的cdna第一链在35~50℃条件下特异性结合，之后热启动taq酶在50~72℃条件下对cdna进行延伸，得到双链dna；
14、3）通用上游引物f、通用下游引物r以及特异性探针p和步骤2）得到的双链dna在热启动taq酶作用下进行扩增反应，并进行实时荧光信号采集，通过对信号的分析，得到荧光扩增曲线，最终完成mirna的定量。
15、优选地，步骤1）中，反转录温度42~50℃，时间5~30min。
16、优选地，步骤1）中，在95℃ 30s~5min条件下对反转录酶灭活的同时激活热启动taq酶。
17、优选地，步骤2）中，若特异性linker引物进行了3’端的磷酸化修饰或c3 spacer修饰，则得到一条再次加长的ssdna。
18、优选地，步骤3）中，在95℃ 5~15s，56~62℃ 30s~1min，40~50循环条件下进行扩增反应。
19、本专利技术的有益效果在于：
20、本专利技术特殊设计的引物组包括特异性茎环引物lp、特异性linker引物、通用上游引物f、通用下游引物r以及特异性探针p，能够保证扩增的特异性；所有反应所需试剂一次加入反应体系中，实验过程简单易操作；逆转录和qpcr过程在一个反应管中进行，避免了反复开盖过程，降低了污染的风险，并降低了人为误差；整个反应时间相对于两步法荧光定量pcr大大缩短，节省了实验时间；通用上游引物和通用下游引物的设计，使mirna的多重扩增成为可能。
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1.一锅法实时荧光定量PCR检测miRNA的方法，其特征在于，通过一锅法实时荧光定量PCR检测miRNA的引物组实现，所述引物组包括特异性茎环引物LP，特异性Linker引物、通用上游引物F、通用下游引物R以及特异性探针P，其中：所述特异性茎环引物LP为茎环结构，一部分是非特异性的通用序列，一部分是与目的miRNA序列3’端互补配对的特异性序列，长度在10~12 bp；所述特异性Linker引物，一部分是非特异性的通用序列，一部分是与目的miRNA序列5’端一致的特异性序列，长度在10~12 bp，所述特异性Linker引物的3’端进行磷酸化修饰或C3 Spacer修饰；所述通用上游引物F和通用下游引物R分别来自所述特异性Linker引物和特异性茎环引物LP上的通用序列部分；所述特异性探针P为修饰探针，长度在13~18bp，5’端进行荧光基团修饰，3’端进行淬灭基团修饰；所述方法包括：
【技术特征摘要】
1.一锅法实时荧光定量pcr检测mirna的方法，其特征在于，通过一锅法实时荧光定量pcr检测mirna的引物组实现，所述引物组包括特异性茎环引物lp，特异性linker引物、通用上游引物f、通用下游引物r以及特异性探针p，其中：所述特异性茎环引物lp为茎环结构，一部分是非特异性的通用序列，一部分是与目的mirna序列3’端互补配对的特异性序列，长度在10~12 bp；所述特异性linker引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜维，杨林，杨松涛，苏畅，苏柏文，
申请(专利权)人：苏州麦锐克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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