【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因改造技术，具体涉及一种工程菌及其构建方法和应用以及发酵生产纽莫康定b0的方法。
技术介绍
1、转录调控因子是在丝状真菌中普遍存在的调控因子，可分为全局性转录调控因子和途径特异性转录调控因子。转录调控因子参与丝状真菌的生长、发育和次级代谢等重要生命过程的调控，尤其对于丝状真菌复杂的、多层次的次级代谢发挥着关键作用。纽莫康定b0是首个半合成棘白菌素类抗真菌药物卡泊芬净的前体物质，是丝状真菌glarealozoyensis发酵产生的次级代谢产物，它能直接抑制合成真菌细胞壁的β-1,3-d-葡聚糖合成酶的活性，从而抑制真菌感染，使细胞壁无法合成而导致真菌死亡。与其它抗真菌物质相比，它具有广泛的应用范围、较强的选择性和较低的副作用。
2、用于提高发酵法生产纽莫康定b0产量的方法主要有诱变、培养基优化、渗透胁迫策略、基因编辑技术等。
3、默克公司通过对glarea lozoyensis atcc 20868进行诱变获得了glarealozoyensis atcc 20957，其主要产物是纽莫康定b0和纽莫康定c0，进一步对glarealozoyensis atcc 20957进行诱变，获得glarea lozoyensis atcc 74030，该菌株中纽莫康定b0产量达到241mg/l，比野生菌株atcc 20868提高了13倍。qin t等以glarea lozoyensisatcc 74030为出发菌株，通过artp诱变原生质体获得了稳定的高产菌株g.lozoyensis q1，纽莫康定b0产
4、培养基优化主要通过前体添加和响应面优化培养基中的各组分。petersen等研究了脯氨酸添加对纽莫康定发酵的影响，脯氨酸的添加增加了纽莫康定b0和纽莫康定e0的产量，减少纽莫康定c0和纽莫康定d0，对纽莫康定b0效价的影响显著，当培养基中添加10g/l脯氨酸时，纽莫康定b0的效价达到494unit/l，是没有添加脯氨酸的1.8倍。杨渊等人通过响应面法优化产纽莫康定b0菌株发酵培养基，结果表明甘露醇、脯氨酸、葡萄糖对该研究效果佳，纽莫康定b0产量提高了42％。
5、纽莫康定b0是一种疏水性次生代谢产物并积累在菌丝体中，由于反馈抑制作用，高浓度纽莫康定b0在体内积累成为一个挑战。调节和增强膜通透性是缓解反馈抑制的重要手段之一。song等人以甘露醇为唯一碳源与渗透调节剂一起开发了一种渗透压控制补料分批策略，该策略导致纽莫康定b0的最大浓度为2711mg/l、生产力为9.05mg/l/h，分别比一阶段发酵获得的最佳结果提高了34.67％和6.47％。
6、目前对生产纽莫康定b0的工程菌的构建主要围绕纽莫康定b0生产菌株中的关键基因。“crispr/cas9-based genome editing in the filamentous fungus glarealozoyensis and its application in manipulating glof”公开了采用crispr/cas9基因编辑技术对菌株g.lozoyensis sipi1208进行改造的方法，敲除glof基因，替换为ap-htye基因，进而得到4个新的菌株，用于生产纽莫康定b0可以很好地避免杂质纽莫康定c0的产生。cn117586892a公开了通过过表达编码非核糖体肽合成酶的基因，使纽莫康定b0发酵产量比野生型菌株提高16-37.4％。
7、对于纽莫康定b0的生产，诱变育种存在突变方向和频率不确定，有益突变体较少的问题；而脯氨酸等氨基酸价格昂贵，通过添加前体氨基酸到发酵培养基中会大大增加生产成本；利用crispr/cas9基因编辑技术对菌株进行改造时存在较高的脱靶效应。因此，即使基于上述多种方式，目前发酵生产纽莫康定b0的最高产量仍较低，难以达到工业化生产的需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的发酵生产纽莫康定b0产量低的问题，提供一种工程菌及其构建方法和应用以及发酵生产纽莫康定b0的方法，该工程菌发酵生产纽莫康定b0的产量较高，为纽莫康定b0的微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。
2、为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种工程菌，该工程菌由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述工程菌过表达全局性转录调控因子gllaea，所述全局性转录调控因子gllaea的氨基酸序列如seq id no：1所示。
3、优选地，编码所述全局性转录调控因子gllaea的基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
4、优选地，所述出发菌株为丝状真菌glarea lozoyensis。
5、优选地，所述出发菌株为glarea lozoyensis atcc74030的突变菌株glarealozoyensis q1。
6、本专利技术第二方面提供一种构建工程菌的方法，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株过表达全局性转录调控因子gllaea；
7、使出发菌株过表达全局性转录调控因子gllaea的方式为在所述出发菌株的基因组中插入编码氨基酸序列如seq id no：1所示的gllaea的基因。
8、优选地，所述出发菌株为丝状真菌glarea lozoyensis。
9、优选地，所述出发菌株为glarea lozoyensis atcc74030的突变菌株glarealozoyensis q1。
10、优选地，使出发菌株过表达全局性转录调控因子gllaea的方式为在所述出发菌株的基因组中插入核苷酸序列如seq id no：2所示的gllaea表达基因。
11、优选地，所述gllaea表达基因的启动子为pgpda，pgpda的核苷酸序列如seq idno：3所示。
12、本专利技术第三方面提供上述的工程菌或上述的方法在生产纽莫康定b0中的应用。
13、本专利技术第四方面提供一种发酵生产纽莫康定b0的方法，该方法包括：将上述的工程菌接种至发酵培养基中进行发酵；
14、或者，按照上述的方法构建工程菌，并将得到的工程菌接种至发酵培养基中进行发酵。
15、优选地，所述发酵的条件包括：温度为25-28℃，转速为200-220rpm，时间为12-18天。
16、优选地，所述发酵培养基含有：葡萄糖、甘露醇、玉米蛋白粉、棉籽饼粉、k2hpo4、fe3(po4)2和mnso4。
17、优选地，所述发酵培养基含有：葡萄糖10-20g/l，甘露醇60-80g/l，玉米蛋白粉10-20g/l，棉籽饼粉20-35g/l，k2hpo4 1.5-3.5g/l，fe3(po4)2 0.2-0.8g/l，mnso4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程菌，其特征在于，该工程菌由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述工程菌过表达全局性转录调控因子GLlaeA，所述全局性转录调控因子GLlaeA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，编码所述全局性转录调控因子GLlaeA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述出发菌株为丝状真菌Glarealozoyensis；
4.一种构建工程菌的方法，其特征在于，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株过表达全局性转录调控因子GLlaeA；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述出发菌株为丝状真菌Glarealozoyensis；
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，使出发菌株过表达全局性转录调控因子GLlaeA的方式为在所述出发菌株的基因组中插入核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的GLlaeA表达基因；
7.权利要求1至3中任意一项所述的工程菌或权利要求4至
8.一种发酵生产纽莫康定B0的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1至3中任意一项所述的工程菌接种至发酵培养基中进行发酵；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件包括：温度为25-28℃，转速为200-220rpm，时间为12-18天；
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件包括：温度为25-28℃，转速为300-500rpm，通气量为0.8-1.2vvm，时间为8-15天；
...【技术特征摘要】
1.一种工程菌，其特征在于，该工程菌由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述工程菌过表达全局性转录调控因子gllaea，所述全局性转录调控因子gllaea的氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，编码所述全局性转录调控因子gllaea的基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述出发菌株为丝状真菌glarealozoyensis；
4.一种构建工程菌的方法，其特征在于，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株过表达全局性转录调控因子gllaea；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述出发菌株为丝状真菌glarealozoyensis；
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，仪萍，杨林晖，杨晴晨，蒋明辉，张歆悦，张明钟，宋萍，余静，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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