【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学，具体地说，涉及一种环形泰勒虫裂殖体转化细胞的培养方法与应用。
技术介绍
1、环形泰勒虫病又称热带泰勒虫病，是由环形泰勒虫寄生于牛单核细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的一种蜱传性血液原虫病。该病在农牧区广泛存在，动物感染后表现的典型临床症状为发热、体表淋巴结肿大、黄疸、急性贫血、血红蛋白尿等，严重时可导致动物死亡，给畜牧养殖业造成巨大的经济损失。
2、传统的环形泰勒虫裂殖体转化细胞培养通常使用含10％-20％胎牛血清的培养基，通过血清向细胞提供贴壁因子、生长因子、激素和营养物质等以保证细胞传代培养。然而，血清作为添加剂存在以下缺点：1)血清成分复杂且不确定，批次之间质量存在差异，这增加了疫苗生产和质量控制难度；2)血清容易引起细菌、真菌、内外源性病毒以及支原体等微生物的污染风险，以及疫苗中残留的血清蛋白易引起接种动物产生过敏反应，一定程度上增加了疫苗生产的安全问题；3)血清本身价格较高且供应量有限，在提高生产成本的同时也增加了生物制品的下游纯化难度。因此在环形泰勒虫病疫苗的应用中若可降低血清含量则可有望克服这些工艺缺陷。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种低血清培养环形泰勒虫裂殖体转化细胞的方法，为环形泰勒虫病疫苗规模化生产提供新的有效方法。
2、本专利技术提供了一种环形泰勒虫裂殖体转化细胞的培养方法，其包括：
3、(1)取悬浮培养的环形泰勒虫裂殖体转化牛淋巴细胞进行复苏，然后置于含10％新生牛血清的第一培养
4、所述第一培养基包括gb培养基和rpmi1640培养基，ph值7.2-7.4，其中，所述gb培养基和rpmi1640培养基的体积比为3:1；
5、(2)驯化细胞适应低血清培养，包括以下步骤：
6、a)将步骤(1)扩增培养的裂殖体转化牛淋巴细胞接种到含8％新生牛血清的第二培养基中，进行传代培养；所述第二培养基包括gb培养基和rpmi1640培养基，ph值7.2-7.4，其中，所述gb培养基和rpmi1640培养基的体积比为1:1；
7、b)将步骤a)传代培养获得的细胞接种到含5％新生牛血清的第二培养基中，进行传代培养；c)步骤b)传代培养获得的细胞接种到含3％新生牛血清的第二培养基中，进行传代培养；所述gb培养基为gibco公司a1627703培养基干粉的溶液，所述a1627703培养基干粉在gb培养基中的浓度为17.5-18g/l；所述rpmi1640培养基为rpmi1640培养基干粉的溶液，所述rpmi1640培养基干粉在rpmi1640培养基中的浓度为24.5-25.5g/l。
8、本专利技术提供了一种低血清培养环形泰勒虫裂殖体转化细胞的方法，该方法通过特定培养基配合血清浓度的不断调整，成功将环形泰勒虫裂殖体转化细胞驯化至适应低血清培养，从而大大降低了牛血清的使用量，降低了生产成本。
9、本专利技术的培养方法中，步骤(1)传代扩增培养的条件为37℃，5％ co2，传代次数为2-3次，每代培养时间为72h。
10、本专利技术的培养方法步骤a)中，所述裂殖体转化牛淋巴细胞处于对数生长期且细胞活性＞90％。
11、本专利技术的培养方法步骤(2)中传代培养的条件为：接种密度为5×105cells/ml，80rpm、37℃，5％ co2摇床培养，每代培养时间为72h。
12、本专利技术结合细胞悬浮培养技术，在有效提高生产效率的同时，能够很快稳定地扩大生产规模，为环形泰勒虫病的弱毒疫苗研发提供基础材料。
13、本专利技术的培养方法步骤a)和b)中传代次数为3次。
14、本专利技术的培养方法步骤c)中传代次数≥50次。
15、本专利技术的培养方法步骤(1)中所述复苏的方法为：将解冻后的细胞加入所述第一培养基中，混匀后以800rpm离心5min，弃去上清。
16、本专利技术还提供上述培养方法在降低环形泰勒虫裂殖体转化细胞培养成本中的应用。
17、本专利技术还提供上述培养方法在减少环形泰勒虫裂殖体转化细胞培养时微生物污染风险中的应用。
18、本专利技术的培养方法降低了血清使用量，从而减少了生产成本，并降低了微生物污染风险。
19、本专利技术还提供上述培养方法在制备环形泰勒虫病疫苗中的应用。
20、制备环形泰勒虫病疫苗的方法可参见：环形泰勒焦虫裂殖体细胞培养及其免疫原性的研究，科学实验1976，doi:10.16656/j.issn.1673-4696.1976.02.003。
21、本专利技术的有益效果至少在于：
22、1、本专利技术低血清培养环形泰勒虫裂殖体转化细胞方法可有效降低培养液中牛血清的使用量，血清含量只需要3％；
23、2、本专利技术提供的使用低血清培养的环形泰勒虫裂殖体转化细胞在低血清培养系统中细胞可连续传代至少50代；
24、3、驯化收获的低血清环形泰勒虫裂殖体转化细胞经姬姆萨染色，细胞染虫率接近100％；本专利技术提供的低血清培养环形泰勒虫裂殖体转化细胞的方法，不仅提升了细胞的质量和产量，而且降低了细胞培养的成本，更适应用于规模化环形泰勒虫病疫苗的生产，为该病的免疫预防提供了有力的技术支持。
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1.一种环形泰勒虫裂殖体转化细胞的培养方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)传代扩增培养的条件为37℃，5％CO2，传代次数为2-3次，每代培养时间为72h。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，步骤a)中，所述裂殖体转化牛淋巴细胞处于对数生长期且细胞活性＞90％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中传代培养的条件为：接种密度为5×105cells/mL，80rpm、37℃，5％CO2摇床培养，每代培养时间为72h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤a)和b)中传代次数为3次。
6.根据权利要求1-5任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤c)中传代次数≥50次。
7.根据权利要求1-6任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述复苏的方法为：将解冻后的细胞加入所述第一培养基中，混匀后以800rpm离心5min，弃去上清。
8.权利要求1-7任一项所述的培养方法在降低环形泰勒
9.权利要求1-7任一项所述的培养方法在减少环形泰勒虫裂殖体转化细胞培养时微生物污染风险中的应用。
10.权利要求1-7任一项所述的培养方法在制备环形泰勒虫病疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种环形泰勒虫裂殖体转化细胞的培养方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)传代扩增培养的条件为37℃，5％co2，传代次数为2-3次，每代培养时间为72h。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，步骤a)中，所述裂殖体转化牛淋巴细胞处于对数生长期且细胞活性＞90％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中传代培养的条件为：接种密度为5×105cells/ml，80rpm、37℃，5％co2摇床培养，每代培养时间为72h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的培养方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：马全英，李志，施朱宜，赵帅阳，韩元，罗建勋，
申请(专利权)人：兰州交通大学，
类型：发明
国别省市：
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