【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种试剂盒，具体涉及基于通用型荧光纳米颗粒计数法结合crispr/cas12a识别用于hpv病毒核酸检测的试剂盒，属于核酸检测领域。
技术介绍
1、核酸包括dna和rna，是遗传信息的载体，可作为多种疾病，如癌症以及病原体感染性疾病诊断的标志物。核酸分子诊断具有灵敏度高、实时性好、操作简便等优势，对癌症以及病原体感染性疾病的早期筛查及诊断具有重要意义。目前常用核酸检测方法主要包括基因测序法和核酸扩增检测法。
2、宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，研究表明，几乎90％以上的宫颈癌是由人乳头瘤病毒(hpv)感染引起的。宫颈癌中最常见的高危型hpv型别为hpv16(55.2％)、18(14.2％)、45(5.0％)、33(4.2％)和58(3.9％)，其中hpv16/18占比约70％。在我国宫颈癌最常见高危型hpv型别为hpv16(59.5％)、18(9.6％)、58(8.2％)、52(6.5％)和33(3.5％)。近年来，我国正处于加速消除宫颈癌的关键时期，使用高质量筛查方法提高筛查覆盖率是消除宫颈癌的主要手段之一。2023年4月25日，中华预防医学会肿瘤预防与控制专业委员会发布《人乳头状瘤病毒核酸检测用于宫颈癌筛查中国专家共识(2022)》，推荐将hpv核酸检测作为我国宫颈癌筛查的主要方法。
3、现有核酸检测方法大多操作步骤复杂且依赖于昂贵的仪器设备，被誉为“基因魔剪”的crispr/cas系统在核酸检测方面展现出巨大潜力和优势。规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly
4、计数法是一种可以检测单个信号源的分析方法，可以实现单分子水平的检测。在计数分析中，基于光学显微成像的计数测量将分子识别反应后产生的单个信号源成像可视化，从而将目标物分子与信号源的数量关联，但是这种以光学信号为基础的计数测量需要单个信号源有很高的亮度，通常有机小分子的亮度不足以使单个发光分子的信号从溶剂的拉曼散射中胜出。共聚焦荧光显微镜能够实现单分子的检测，且荧光纳米颗粒表面或内部可标记或封装数千个有机荧光小分子，具有非常高的成像亮度和丰富的编码元素，具有光谱可调控、光学性能稳定、生物相容性好、表面易修饰以及成本低廉等优点，可以通过荧光显微镜观察荧光纳米颗粒实现计数检测，非常适于对目标核酸的常规荧光显微成像计数分析。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了基于通用型荧光纳米颗粒计数法结合crispr/cas12a识别用于hpv病毒核酸检测的试剂盒，以hpv16/18为例，利用crispr/cas12a反式切割活性以及荧光纳米颗粒特性，构建了通用型荧光纳米计数方法结合crispr/cas12a用于hpv病毒核酸，简化了操作，降低了成本，同时应用于hpv假病毒核酸检测中，具有良好的分析性能。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、基于通用型荧光纳米颗粒计数法结合crispr/cas12a识别用于hpv病毒核酸检测的试剂盒，以检测体系浓度计，包括0.5μl 20μm crrna 500nm、0.5μl 10μm cas12a蛋白250nm、2μl 1μm linker链(10nm)、14.5μl缓冲液3.1、0.5μl rna酶抑制剂、2μl 10nmtarget-hpv16100 pm或2μl10nm target-hpv18100 pm，40μl hpv-mb修饰的磁纳米颗粒，10μlhpv-fnp修饰的荧光纳米颗粒。
4、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进：
5、进一步，所述crrna为crrna-hpv16或crrna-hpv18；
6、所述crrna-hpv16的序列为：uaauuucuacuaaguguagau gaauacauuuaccugacccc；
7、所述crrna-hpv18的序列为：uaauuucuacuaaguguagau gaagauggugauaugguaga。
8、进一步，还包括引物，目标物为hpv16时，引物序列为：
9、hpv16-forward primer：aag tat cag gat tac aat cac ggg t；hpv16-reverseprimer：acc aaa ctt att ggg gtc agg t；
10、目标物为hpv18时，引物序列为：
11、hpv18-forward primer：tgg cgg cct agt gac aat ac；hpv18-reverse primer：agc aca ggc cca cac taa ac。
12、进一步，所述cas12a蛋白为cpf1核酸内切酶。
13、进一步，所述linker链序列为：tac cat ttt ttt aac tta ttt ggt a。
14、进一步，所述rna酶抑制剂为由大肠杆菌中纯化的猪肝rna酶抑制剂得到的重组体。
15、进一步，所述target-hpv16序列为：gtt cct aaa gta tca gga tta caa tac agggta ttt aga ata cat tta cct gac ccc aataag ttt ggt ttt cct gacacc tca ttt tataat cca gat a；
16、所述target-hpv18序列为：cgt cct tta tca cagggc gcc tgc ccc cct tta gaactt aaa aac aca gtt ttg gaa gat ggt gat atg gta gat act gga tat ggt gcc atggac ttt a。
17、进一步，所述hpv-mb序列：taa aaa aat ggt a；hpv-fnp序列：taccaaataagt。
18、进一步，所述磁纳米颗粒表面修饰dna链的方法为：
19、取200μl链霉亲和素修饰的磁纳米颗粒，用1ml pbs洗涤3次并重新分散于1ml pbs中，加入25μl 100mm生物素修饰的dna，于25℃，1500rpm，震荡反应15min；加入1ml 0.1％triton-x100 pbs磁分离，重复洗涤5次，去除未反应的寡核酸序列，重新分散至1ml 0.1％triton-x100 pbs中，于4℃保存备用。
20、所述荧光纳米颗粒表面修饰dna的方法为edc催化的氨基与羧基的缩合反应：
21、用纯净水将氨基修饰的dna干粉溶解至100μm。取10μl 10mg/ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于通用型荧光纳米颗粒计数法结合CRISPR/Cas12a识别用于HPV病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，以检测体系浓度计，包括0.5μL20μMcrRNA500nM、0.5μL10μMCas12a蛋白250nM、2μL1μMLinker链(10nM)、14.5μL缓冲液3.1、0.5μLRNA酶抑制剂、2μL10nMTarget-HPV16100pM或2μL10nMTarget-HPV18100pM，40μLHPV-MB修饰的磁纳米颗粒，10μLHPV-FNP修饰的荧光纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA为crRNA-HPV16或crRNA-HPV18；
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括引物，目标物为HPV16时，引物序列为：
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas12a蛋白为Cpf1核酸内切酶。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Linker链序列为：TACCATTTTTTTAACTTATTTGGTA。
6.根据权利要求1所述的试剂
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Target-HPV16序列为：GTTCCTAAAGTATCAGGATTACAATACAGGGTATTTAGA ATACATTTACCTGACCCCAATAAGTTTGGTTTTCCTGACACCTCATTTTATAATCCAGATA；
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HPV-MB序列：TAAAAAAATGGTA；HPV-FNP序列：TACCAAATAAGT。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁纳米颗粒表面修饰DNA链的方法为：
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光纳米颗粒表面修饰DNA的方法为EDC催化的氨基与羧基的缩合反应：
...【技术特征摘要】
1.基于通用型荧光纳米颗粒计数法结合crispr/cas12a识别用于hpv病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，以检测体系浓度计，包括0.5μl20μmcrrna500nm、0.5μl10μmcas12a蛋白250nm、2μl1μmlinker链(10nm)、14.5μl缓冲液3.1、0.5μlrna酶抑制剂、2μl10nmtarget-hpv16100pm或2μl10nmtarget-hpv18100pm，40μlhpv-mb修饰的磁纳米颗粒，10μlhpv-fnp修饰的荧光纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crrna为crrna-hpv16或crrna-hpv18；
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括引物，目标物为hpv16时，引物序列为：
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述cas12a蛋白为cpf1核酸内切酶。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述li...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴晓静，刘思彤，徐丽，黄朝鹤，李姝静，何一凡，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：
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