【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药提取物，具体涉及一种藏药柳茶及其中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用。
技术介绍
1、随着生活条件的改善和饮食结构的改变，全球肥胖人口逐渐增加。肥胖不仅会引起生理和代谢异常，还会带来一系列心理和社会问题，已逐渐成为一个严重的全球性公共卫生问题。胰脂肪酶能水解日常饮食中50-70%的甘油三酯，在脂质代谢中起着极其重要的作用。奥利司他是一种fda批准的脂肪酶抑制剂，对肥胖有良好的治疗作用，但存在肝损伤和不良胃肠道症状等副作用。近年来，植物源性胰脂酶抑制剂因其结构多样性、低毒性和来源广泛而备受关注。
2、柳茶的原植物为蔷薇科鲜卑花属植物窄叶鲜卑花 sibiraea angustata(rehd.)hand.-mazz.，生长在海拔2400～3500米的高山、溪边或林缘。因其叶形似柳，藏族民间常作茶饮，用来治疗便秘和食后腹胀等症，俗称“柳茶”。现代药理学研究表明，柳茶具有非常显著的减肥降脂功效。柳茶的化学成分包括萜类、黄酮、山梨醇酯等化学成分。我们之前的研究发现，与α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶相比，柳茶对胰脂肪酶具有更好的抑制活性（图1）。然而，其发挥药效的具体成分尚不清楚。
3、从天然产物中筛选活性成分的传统方法有电化学法、薄层色谱法、比色法和荧光活性测定法等，这些方法通常需要复杂的样品制备过程，耗时耗力。亲和超滤是一种将亲和捕获与超滤技术结合的先进技术，近年来逐渐应用于复杂天然产物中药效成分的快速筛选，具有操作简单、筛
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种药柳茶中具有胰脂肪酶抑制活性化合物的分离方法及作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用。为了实现该目的，本专利技术首先采用体外胰脂肪酶抑制实验筛选了柳茶的最佳活性提取部位；采用亲和超滤-高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱方法从柳茶提取物中筛选胰脂肪酶抑制活性化合物；采用分子对接技术对目标化合物与胰脂肪酶的结合能力进行比较，筛选出结合能力最强的目标化合物；采用大孔树脂和制备色谱方法对其中2种结合能力较强的黄酮类成分进行了定向分离；进一步采用体外胰脂肪酶抑制实验考察其体外胰脂肪酶抑制活性。最终，从柳茶提取物中筛选到异槲皮素、金丝桃苷、咖啡酰二葡萄糖苷、sibiraglycosides a、sibiraglycosides b、sibiraglycosides c、sibiraglycosidesd、sibiraglycosides e、sibiraglycoside g、sibiraglycoside h、sibiraglycoside s、sibiraglycoside p、sibiraglycosideq、槲皮素3,4'-二葡萄糖苷、荆芥苷、槲皮素3-o-α-l-阿拉伯糖-(1→2)-β-d-葡萄糖-7-β-d-葡萄糖苷16个活性物质，并对其中结合能力较强的2个目标化合物进行了定向分离。经活性实验证明，柳茶提取物和所分离活性成分均具有良好的胰脂肪酶抑制活性，有望应用于减肥降脂药物的开发。
2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、本专利技术柳茶提取物及其中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，所述活性化合物为具有胰脂肪酶抑制活性化合物，包括咖啡酰二葡萄糖苷、sibiraglycosides a、sibiraglycosides b、sibiraglycosides c、sibiraglycosidesd、sibiraglycosides e、sibiraglycoside g、sibiraglycoside h、sibiraglycoside s、sibiraglycoside p、sibiraglycosideq、槲皮素3,4'-二葡萄糖苷、荆芥苷、槲皮素3-o-α-l-阿拉伯糖-(1→2)-β-d-葡萄糖-7-β-d-葡萄糖苷中的至少一种。
4、本专利技术具有胰脂肪酶抑制活性化合物的制备方法，包括以下步骤：
5、（1）将柳茶干燥粉末分别用乙醇和水回流提取，收集提取液混合，浓缩干燥，得到总提取物；将总提取物用水悬浮，采用萃取溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物，剩余的作为水提取部位；
6、回流提取的提取条件为：分别用75%乙醇和水回流提取3次，每次提取2 h，提取温度55~85 ℃，料液比为1:5 ~1:20 kg/l；萃取条件为：萃取2-6次，萃取溶剂和总提取物溶液的体积比为1:1 ~1:3。
7、（2）将柳茶乙酸乙酯或正丁醇提取物溶液、tris-hcl缓冲液和胰脂肪酶溶液，混合后孵育，转移到超滤管中高速离心；tris-hcl缓冲液洗涤去除未结合的化合物；更换新的超滤管外管，加入乙腈使蛋白-配体复合物解离；重复超滤离心过程，收集滤液，进行高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析，筛选到的化合物即为潜在的胰脂肪酶抑制活性成分：异槲皮素、金丝桃苷、咖啡酰二葡萄糖苷、sibiraglycosides a、sibiraglycosides b、sibiraglycosides c、sibiraglycosidesd、sibiraglycosides e、sibiraglycoside g、sibiraglycoside h、sibiraglycoside s、sibiraglycoside p、sibiraglycosideq、槲皮素3,4'-二葡萄糖苷、荆芥苷、槲皮素3-o-α-l-阿拉伯糖-(1→2)-β-d-葡萄糖-7-β-d-葡萄糖苷。
8、所述柳茶乙酸乙酯或正丁醇提取物溶液在反应体系中的终浓度为0.1~2.0 mg/ml，所述胰脂肪酶溶液在反应体系中的终浓度为0.1~2.0 mg/ml；所述tris-hcl缓冲液的ph为7.2~8.6。
9、所述孵育是在37 ℃孵育30~90分钟；所述超滤离心是在4 ℃、9000~12000 r/min离心30分钟。
10、所述高效液相色谱条件：thermo acclaimtm 120 c18色谱柱，规格为2.1 × 250mm，5 μm；柱温30 ℃；流动相a：乙腈；流动相b：体积浓度为0.4%的乙酸水溶液；梯度洗脱条件为：0-5 min，5%-10% a，5-50 min，10%-20%a，50-80 min，20%-40%a，80-85 min，40%-45%a；流速0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：所述活性化合物为具有胰脂肪酶抑制活性的化合物，包括咖啡酰二葡萄糖苷、Sibiraglycosides A、Sibiraglycosides B、Sibiraglycosides C、Sibiraglycosides D、Sibiraglycosides E、Sibiraglycoside G、Sibiraglycoside H、Sibiraglycoside S、Sibiraglycoside P、Sibiraglycoside Q、槲皮素3,4'-二葡萄糖苷、荆芥苷、槲皮素3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-β-D-葡萄糖-7-β-D-葡萄糖苷中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：具有胰脂肪酶抑制活性化合物的分离方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：回流提取的提取条件为：分别用75%乙醇
4.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：所述柳茶乙酸乙酯或正丁醇提取物溶液在反应体系中的终浓度为0.1~2.0 mg/mL，所述胰脂肪酶溶液在反应体系中的终浓度为0.1~2.0 mg/mL；所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.2~8.6。
5.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：所述孵育是在37 ℃孵育30~90分钟；所述超滤离心是在4 ℃、9000~12000 r/min离心30分钟。
6.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：所述高效液相色谱条件：Thermo AcclaimTM 120 C18色谱柱，规格为2.1 × 250 mm，5 μm；柱温30 ℃；流动相A：乙腈；流动相B：体积浓度为0.4%的乙酸水溶液；梯度洗脱条件为：0-5 min，5%-10% A，5-50 min，10%-20%A，50-80 min，20%-40%A，80-85 min，40%-45%A；流速0.3 mL/min。
7.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：所述质谱条件：电子喷雾电离源，负离子模式，毛细管电压4500 V，干燥温度220 ℃，干燥气流速8 L/min，碰撞能量为40 eV，扫描范围为50-1500amu。
8.藏药柳茶中具有胰脂肪酶抑制活性化合物的定向分离方法，具有胰脂肪酶抑制活性化合物为槲皮素3,4'-二葡萄糖苷和荆芥苷，分离方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的藏药柳茶中具有胰脂肪酶抑制活性化合物的定向分离方法，其特征在于：回流提取的提取条件为：分别用75%乙醇和水回流提取3次，每次提取2 h，提取温度55~85 ℃，料液比为1:5 ~1:20 kg/L；萃取条件为：萃取2-6次，正丁醇和总提取物溶液的体积比为1:1 ~1:3。
10.根据权利要求8所述方法分离的具有胰脂肪酶抑制活性化合物的在制备减肥降脂药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：所述活性化合物为具有胰脂肪酶抑制活性的化合物，包括咖啡酰二葡萄糖苷、sibiraglycosides a、sibiraglycosides b、sibiraglycosides c、sibiraglycosides d、sibiraglycosides e、sibiraglycoside g、sibiraglycoside h、sibiraglycoside s、sibiraglycoside p、sibiraglycoside q、槲皮素3,4'-二葡萄糖苷、荆芥苷、槲皮素3-o-α-l-阿拉伯糖-(1→2)-β-d-葡萄糖-7-β-d-葡萄糖苷中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：具有胰脂肪酶抑制活性化合物的分离方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：回流提取的提取条件为：分别用75%乙醇和水回流提取3次，每次提取2 h，提取温度55~85 ℃，料液比为1:5 ~1:20 kg/l；萃取条件为：萃取2-6次，萃取溶剂和总提取物溶液的体积比为1:1 ~1:3。
4.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离的活性化合物作为胰脂肪酶抑制剂在制备减肥降脂药物中的应用，其特征在于：所述柳茶乙酸乙酯或正丁醇提取物溶液在反应体系中的终浓度为0.1~2.0 mg/ml，所述胰脂肪酶溶液在反应体系中的终浓度为0.1~2.0 mg/ml；所述tris-hcl缓冲液的ph为7.2~8.6。
5.根据权利要求2所述的藏药柳茶中分离...
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