【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子检测，具体涉及一种lmtia技术鉴别怀牛膝的引物组、检测方法、试剂盒与应用。
技术介绍
1、怀牛膝是一种常用中药，来源于苋科多年生草本植物怀牛膝的干燥根。其主产于河南焦作(古怀庆府)，是河南的“四大怀药”之一，种植历史悠久、质量优良、产量较大，被认为《神农本草经》中所载上品。怀牛膝是我国大宗药材之一，市场需求较大。怀牛膝常用于补肝肾、强筋骨，对于肝肾亏虚、腰膝酸痛、下肢痿软无力，用怀牛膝往往取得的临床效果会更好。川牛膝常用于活血祛瘀，对于血滞症，用川牛膝会有更好的临床疗效。总之，两者的功效都能够活血祛瘀、补肝肾、强筋骨、利尿通利、隐血引火、引药下行，怀牛膝偏重于补，而川牛膝偏重于通，这是二者最本质的区别。
2、从牛膝的临床用药安全上来说，市场上怀牛膝的伪品较少但易混品较多，除同科植物川牛膝外，一些根茎类药材例如党参、桔梗、北沙参等在外观形态上与怀牛膝相似，易被作为怀牛膝误用，造成用药混乱，疗效不当的后果。因此，选择一种科学的鉴定方法来快速准确地鉴别河南道地药材怀牛膝，对于安全合理用药具有重要意义。
3、目前鉴别不同产地牛膝的方法包括显微鉴定、理化鉴定、液相色谱-质谱联用技术结合多元统计分析技术的分析方法、液相色谱指纹图谱、红外光谱结合机器学习方法和多重位点特异性pcr鉴别方法等。在以上建立的方法中，显微鉴定、理化鉴定不够精确；色谱质谱技术设备昂贵，对操作人员的专业技术要求高；近红外光谱需要与其他方法联合，光谱数据量大，不易实现快速检测。
4、现代分子生物技术以pcr为代表
5、自2021年梯型熔解温度等温扩增技术(ladder-shape melting temperatureisothermalamplification,lmtia)报道以来，因其非热循环、非酶的单链模板生产优点，只需一对引物就可在20分钟内完成扩增，从而成为继pcr和lamp技术之后又一快速简便的核酸扩增新技术。lmtia技术解决了lamp技术中因非特异性扩增、气溶胶污染、引物二聚体引起的假阳性问题，具有成本低廉、特异性强、灵敏度高等优势。
6、目前尚未见有采用proofman荧光探针与lmtia体系相结合，在20分钟内完成怀牛膝源性成分的快速检测。国内外尚未见报道能够快速、简便、特异且灵敏地检测中药材药品等样品中怀牛膝源性成分的方法和试剂盒。
7、因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的怀牛膝源性成分的检测方法，进行中药材药品中怀牛膝源性成分的快速检测。
技术实现思路
1、本专利技术拟采用最新的lmtia技术(技术原理详见专利号cn202011105405.3)，设计lmtia引物、探针，建立怀牛膝源成分的快速检测方法，为中药材药品中怀牛膝源成分的监管提供技术支撑。本专利技术的一个目的是提供了一种lmtia技术鉴别怀牛膝的引物组、检测方法、试剂盒，用于检测中药材药品中的怀牛膝源成分，提高中药材药品安全监管检测技术。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、用于检测怀牛膝源成分的lmtia引物组、探针等序列如下：
4、hniux-f：5`-atatcacgccgggttttcttgattggtggtgctgcc-3`
5、hniux-b：5`-cccggcgtgatatttttacactctcatttttgttccttggc-3`
6、hniux-lf：5`-gttcgttattgtgttg-3`
7、hniux-探针：5`-bhq2-gttcgttattgtgtta-3`6-fam
8、本专利技术的第2个目的是提供用于检测怀牛膝源成分的试剂，具体的技术方案为：包括通用型lmtia预混液、bst聚合酶、lmtia引物和hniux-探针。
9、本专利技术的第3个目的在于提供用于检测怀牛膝源成分的试剂盒，具体的技术方案为：包括如上所述的用于检测怀牛膝成分的lmtia引物探针或如上所述的用于检测怀牛膝成分的试剂。
10、本专利技术的第4个目的在于提供用于检测怀牛膝成分的方法，具体的技术方案为：包括如下步骤：(1)提取样品dna；(2)采用如权利要求1所述的lmtia引物组、探针或如权利要求3所述的试剂或如权利要求4所述的试剂盒配制lmtia反应体系；(3)将配制好的lmtia反应体系置于实时荧光pcr仪中进行恒温扩增；(4)扩增20分钟后观察扩增曲线。(5)若扩增结果图中出现指数曲线，则该样品含有怀牛膝源成分；若扩增结果中没有出现扩增曲线，则样品中不含有怀牛膝源成分。
11、优选的，所述恒温扩增的温度为54℃，等温扩增的时间为20分钟。
12、优选的，所述lmtia反应体系中hniux-f：hniux-b：hniux-lf：hniux-探针的摩尔比为4：4：1：1。
13、本专利技术提供上述用于检测中药材药品中怀牛膝源成分的lmtia引物组、探针、试剂、试剂盒的用途，可用于检测中药材药品中怀牛膝源成分。
14、本专利技术的有益效果是：本专利技术的用于检测怀牛膝源成分的lmtia引物组、探针具有良好的重复性、特异性和灵敏度，检测速度快，在恒温条件下即可实现对样品中的怀牛膝源成分的检测。
15、本专利技术的lmtia引物组、探针在54℃时特异性更好。
16、本专利技术的lmtia引物组、探针的绝对灵敏度可达50pg/μl，相对灵敏度可达0.1％。
17、本专利技术的检测怀牛膝源成分的方法简单快速，恒温反应20分钟即可获取检测结果。
18、本专利技术的lmtia引物组、探针可用于检测怀牛膝源成分。
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1.用于检测怀牛膝源成分的LMTIA引物组、探针，其特征在于，所述引物组的序列为：
2.根据权利要求1所述的引物组合，其中在怀牛膝HNiuX-探针的5’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ2，3’端连接有一个荧光报告基团6-FAM。
3.用于检测怀牛膝源成分的试剂，其特征在于，包括通用型LMTIA预混液、Bst聚合酶和如权利要求1所述的LMTIA引物组、探针。
4.用于检测怀牛膝源成分的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的LMTIA引物组、探针或如权利要求3所述的用于检测怀牛膝源成分的试剂。
5.检测怀牛膝源成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)采用如权利要求1所述的LMTIA引物组、探针或如权利要求3所述的试剂或如权利要求4所述的试剂盒配制LMTIA反应体系；(3)将配制好的LMTIA反应体系置于实时荧光PCR仪中进行恒温扩增；(4)扩增20分钟后观察扩增曲线。(5)若扩增结果图中出现指数曲线，则该样品含有怀牛膝源成分；若扩增结果中没有出现扩增曲线，则样品中不含有怀牛膝源成分。
6.根据权利
7.根据权利要求5所述的检测怀牛膝源成分的方法，其特征在于，所述LMTIA反应体系中HNiuX-F：HNiuX-B：HNiuX-LF：HNiuX-探针的摩尔比为4：4：1：1。
8.根据权利要求1所述的LMTIA引物组、探针的用途，其特征在于，在检测怀牛膝源成分中的应用。
9.根据权利要求8所述的LMTIA引物组、探针的用途，其特征在于，在检测中药材药品中怀牛膝源成分中的应用。
...【技术特征摘要】
1.用于检测怀牛膝源成分的lmtia引物组、探针，其特征在于，所述引物组的序列为：
2.根据权利要求1所述的引物组合，其中在怀牛膝hniux-探针的5’端连接有一个荧光淬灭基团bhq2，3’端连接有一个荧光报告基团6-fam。
3.用于检测怀牛膝源成分的试剂，其特征在于，包括通用型lmtia预混液、bst聚合酶和如权利要求1所述的lmtia引物组、探针。
4.用于检测怀牛膝源成分的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的lmtia引物组、探针或如权利要求3所述的用于检测怀牛膝源成分的试剂。
5.检测怀牛膝源成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样品dna；(2)采用如权利要求1所述的lmtia引物组、探针或如权利要求3所述的试剂或如权利要求4所述的试剂盒配制lmtia反应体系；(3)将配制...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔鹏飞，王德国，杨乐雨，胡桢晴，姚蔚，宋春美，刘金鑫，肖付刚，孙军涛，郭孝辉，尹百灵，贾雅婧，杨佳雪，郭梦如，赵梦婷，周佳怡，张赛赛，
申请(专利权)人：许昌学院，
类型：发明
国别省市：
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