【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于组织冻存，具体涉及一种组织无血清玻璃化冻存液及其应用。
技术介绍
1、活体组织具有重要的临床和科研价值，能否实现长期高质量地维持组织体外保存的活性是实现这些价值的关键。一般认为，生物材料在深低温(小于-130℃)下，内部的动能和分子运动减缓，化学和生物反应速率降低，代谢、转运、酶反应和扩散等过程很弱，理论上可被无限期储存。深低温保存技术已成功应用于细胞、精子等单一的，小体积的生物材料的保存。但是，对于生物组织而言，其由多种多层细胞组成，其结构复杂性会限制热的传导和冷冻保护剂(cpa)的渗透，导致其原本的生理结构功能很难被完整保存。
2、近年来，探索复杂组织长期高质量冷冻保存已成为国际上新的研究热点。现有公开的专利中也涉及组织冻存液领域，主要包括：脐带(专利公开号：cn104472473a、cn113133444a、cn116941606a)、胎盘(专利公开号：cn116171984a)、脂肪(专利公开号：cn102907416a、cn106465710a、cn110547286a、cn109845728a、cn110973121a、cn111449055a)、肿瘤(专利公开号：cn107041362a、cn113475500a、cn114467913a)和卵巢(专利公开号：cn111789107a、cn111789106a、cn110074097a、cn110352949a)等组织，但是上述的组织冻存液存在以下不足。
3、首先，大多数冻存液的研发是基于程序化保存的原理，其包含精确而复杂的降温
4、其次，现有的组织冻存液仅针对某单一组织进行研发，其配方简单，应用范围窄，可用于多种组织的冻存液仅有2篇。其中，中国专利技术专利cn114946836a公开了一种可用于乳腺类器官、肾癌类器官、膀胱类器官、小肠类器官和肺类器官的微组织冻存液，但其采用的是程序性保存技术，需严格控制降温速率为0.5～3℃/min，且24h后才能转入液氮中长期保存。最后，大多数的冻存液中含有胎牛血清，不仅存在成分不明的异种免疫原，在临床应用过程中会存在潜在的安全性风险。
5、理想的组织保存液应该具备以下特点：1)渗透性好，能渗透多层细胞进入组织内部；2)基于玻璃化保存的原理，最大程度地抑制冰晶生长等致命损伤以提高组织复苏后的活性，且无需昂贵的程序降温仪严格控制降温步骤；3)适用于多种组织的长期保存；4)避免引入动物血清等异种免疫原。目前尚无符合上述的特点的冻存液，因此，迫切需要建立一种适用于多种生物组织的无血清玻璃化冻存液。
技术实现思路
1、为了克服现有技术缺陷，本专利技术提出一种组织无血清玻璃化冻存液，采用该冻存液进行人和动物组织的冻存，可以有效维持组织的冻存活性及组织结构和功能完整性，复苏率高达90％以上。
2、本专利技术第一方面的目的，在于提供一种无血清玻璃化冻存液。
3、本专利技术第二方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的无血清玻璃化冻存液的应用。
4、本专利技术第三方面的目的，在于提供一种试剂盒。
5、本专利技术第四方面的目的，在于提供一种组织冻存方法。
6、为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
7、本专利技术的第一个方面，提供一种无血清玻璃化冻存液，包括渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、能量代谢调节剂、抗氧化剂和培养基。
8、所述能量代谢调节剂可以减少组织在低温中三磷酸腺苷合成不足所造成损伤，以及提供一定的营养成分。所述抗氧剂可以减轻冷冻过程中活性氧大量产生所造成的细胞损伤。并且该冻存液不含其他动物蛋白成分，避免了引入未知病原菌带来的潜在风险。此外，所述冻存液适用于玻璃化冻存，可有效避免冻存过程中的冰晶损伤。采用该冻存液进行人和动物组织的冻存，可以有效维持组织的冻存活性和组织结构和功能完整性，复苏率高达90％以上。
9、在本专利技术一些实施方式中，所述无血清玻璃化冻存液包括渗透性冷冻保护剂35～50v/v％、非渗透性冷冻保护剂1000～1100mmol/l、能量代谢调节剂1900～2100mmol/l、抗氧化剂5～20mmol/l和培养基。
10、在本专利技术一些优选实施方式中，所述无血清玻璃化冻存液包括渗透性冷冻保护剂40～45v/v％、非渗透性冷冻保护剂1000～1050mmol/l、能量代谢调节剂2000～2100mmol/l、抗氧化剂5～15mmol/l和培养基。
11、在本专利技术一些更优选实施方式中，所述无血清玻璃化冻存液包括渗透性冷冻保护剂40～45v/v％、非渗透性冷冻保护剂1000～1020mmol/l、能量代谢调节剂2000～2020mmol/l、抗氧化剂6～10mmol/l和培养基。
12、在本专利技术一些实施方式中，所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜和多元醇。
13、在本专利技术一些实施方式中，所述多元醇包括乙二醇、丙二醇、丙三醇中的一种或多种。
14、在本专利技术一些优选实施方式中，所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜和乙二醇。
15、二甲基亚砜和乙二醇作为渗透性冷冻保护剂，是能够穿透质膜并与水分子形成氢键以降低冰点而防止细胞内外结冰的小分子。目前普遍认为，乙二醇搭配二甲基亚砜使用是玻璃化冷冻保护剂的首选。相较于其他冷冻保护剂，二甲基亚砜渗透性强、相对分子质量较低、较低浓度即可形成稳定的玻璃化状态，是细胞低温保存的基本冷冻保护剂。然而，二甲基亚砜对组织细胞有较强的生化毒性，降低其浓度有利于提高玻璃化保存后组织细胞的生物活性。乙二醇渗透性强，毒性小，但玻璃化形成能力稍差。因此，二者的联合使用可优势互补，并且大量的研究已表明乙二醇联合二甲基亚砜使用冻存神经组织、卵巢组织、胚胎、卵母细胞等的效果优于单独使用二甲基亚砜或乙二醇。此外，非渗透性(蔗糖)和渗透性冷冻保护剂的组合能够进一步减少渗透性冷冻保护剂的细胞毒性作用，改善玻璃化冷冻的结果。
16、在本专利技术一些实施方式中，所述非渗透性保护剂包括人血清白蛋白和水溶性糖。
17、在本专利技术一些实施方式中，所述水溶性糖包括蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、葡聚糖中的一种或多种。
18、在本专利技术一些实施方式中，所述非渗透性保护剂包括人血清白蛋白和蔗糖。
19、人血清白蛋白既能降低副反应，又能起到稳定蛋白质的作用。蔗糖是天然的非还原糖，是所有双糖中最有效的低温保护剂，其作为非渗透性保护剂，在冷却过程中不会穿透质膜，而是在质膜之本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无血清玻璃化冻存液，包括渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、能量代谢调节剂、抗氧化剂和培养基。
2.根据权利要求1所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述无血清玻璃化冻存液包括渗透性冷冻保护剂35～50v/v％、非渗透性冷冻保护剂1000～1100mmol/L、能量代谢调节剂1900～2100mmol/L、抗氧化剂5～20mmol/L和培养基。
3.根据权利要求1或2所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜和多元醇；和/或，所述非渗透性保护剂包括人血清白蛋白和水溶性糖。
4.根据权利要求3所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述多元醇包括乙二醇、丙二醇、丙三醇中的一种或多种；和/或，所述水溶性糖包括蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、葡聚糖中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述能量代谢调节剂包括氢化可的松、胰岛素、谷氨酰胺、三磷酸腺苷中的至少一种；和/或，所述抗氧剂包括褪黑素、表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇中的至少一种。
6.权利要求5所述的无血
7.权利要求1～6中任一项所述的无血清玻璃化冻存液在(1)或(2)中的应用：
8.一种试剂盒，包括权利要求1～6中任一项所述的无血清玻璃化冻存液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基础液；优选地，所述基础液包括氢化可的松、胰岛素、谷氨酰胺、三磷酸腺苷、褪黑素、表没食子儿茶素没食子酸酯和白藜芦醇。
10.一种组织冻存方法，包括使用权利要求1～6中任一项所述的无血清玻璃化冻存液或权利要求8或9所述的试剂盒处理组织的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种无血清玻璃化冻存液，包括渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、能量代谢调节剂、抗氧化剂和培养基。
2.根据权利要求1所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述无血清玻璃化冻存液包括渗透性冷冻保护剂35～50v/v％、非渗透性冷冻保护剂1000～1100mmol/l、能量代谢调节剂1900～2100mmol/l、抗氧化剂5～20mmol/l和培养基。
3.根据权利要求1或2所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜和多元醇；和/或，所述非渗透性保护剂包括人血清白蛋白和水溶性糖。
4.根据权利要求3所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述多元醇包括乙二醇、丙二醇、丙三醇中的一种或多种；和/或，所述水溶性糖包括蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、葡聚糖中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的无血清玻璃化冻存液，其特征在于，所述能量代谢调节剂包括氢化可的松、胰岛...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗勇，李汶真，樊俊兵，胡志奇，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：
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