【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种新型rna编辑组合物及其应用。
技术介绍
1、阿尔茨海默病(ad)是发病率最高的神经退行性疾病。现有治疗ad的常见药物为对症治疗化学或单抗药物，虽可在一定程度上可以缓解症状，但都无法延迟病程且出现多重用药的不良反应。
2、现下，基于rna编辑技术的生物类等位基因治疗方法，为改善ad“缺医少药”的现状带来了可能，例如，靶向粉样前体蛋白突变基因(appswe)，从而敲低appswe蛋白的生成，进而减少脑内β淀粉样蛋白(aβ)的产生。
3、目前的rna编辑技术包括经典rna干扰技术(rna interference，rnai)，及以cas13、cas7-11等为代表的crispr技术。但是，相关专利基本掌握在国外公司和专家手中，专利权不自主；crispr技术几乎都依赖pfs序列定位，限制了锚定范围；重要核酸酶(如rna编辑器cas7-11)分子量过大，远超过许多递送载体(如aav)的载量；只能依赖rna引导探针等等。虽然经过改造，但如果只依然围绕crispr系统，可能仍无法脱离cas蛋白固有的问题，甚至还会额外增加不利因素。
4、具体ad治疗中，靶向appswe基因组dna的crispr/cas9，会损伤患者遗传物质，引发安全性担忧；靶向appswe mrna更安全，但对应的crispr/cas13和rnai技术特异性不够，会误伤非致病野生型appwt(appwt与appswe仅2个碱基差异，很容易脱靶)，影响神经细胞正常功能。
5、因此，亟需开发一
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提供一种可被rna探针介导的，不依赖pfs序列、小体积、高特异性的新型rna编辑组合物及其应用。利用本专利技术的组合物能够实现对阿尔茨海默病的基因干预。因此，能够将本专利技术的rna编辑组合物用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
2、专利技术人已经公开了“一种用于任意核酸编辑的组合物及方法”(cn202010157724.2)。该申请公开了fen1类功能蛋白与dna探针组合物对核酸物质的切割作用。与之不同的，在本专利技术中，专利技术人公开的rna编辑组合物，是由另一种非fen1家族的功能蛋白与rna探针共同形成的组合物，利用这种组合物对细胞或动物的内源或外源核酸物质进行切割。
3、技术方案：本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
4、本专利技术提供了一种新型rna编辑组合物，该组合物包含：
5、组分(i)：taqtth蛋白或者编码该蛋白质的多核苷酸；
6、组分(ii)：至少一个寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针由两部分组成，一部分为能够与靶标基因互补的引导序列；另一部分具有核酸二级结构；
7、所述的寡核苷酸探针为dna探针或rna探针：
8、所述taqtth蛋白或者编码该蛋白质的多核苷酸既能够识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构，从而与探针结合，还能够切割靶rna底物。
9、组分(i)中，所述taqtth蛋白选自以下任一种：
10、(1)thermus aquaticus dna polymerase或其突变体的部分功能域或全酶片段；
11、(2)thermus thermophilus dna polymerase或其突变体的部分功能域或全酶片段；
12、(3)thermus aquaticus dna polymerase和/或thermus thermophilus dnapolymerase的全酶或片段的融合物。
13、本专利技术一种优选地实施方式是，所述taqtth蛋白为thermus aquaticus dnapolymerase和thermus thermophilus dna polymerase中各一部分融合之后形成的一种嵌合功能蛋白，其核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
14、所述taqtth蛋白分子在c端或n端含一个或多个核导出信号；所述编码taqtth蛋白分子的多核苷酸为dna或rna。
15、组分(ii)中，所述寡核苷酸探针为化学合成的寡核苷酸探针，或插入质粒骨架构建成的质粒。
16、所述寡核苷酸探针的核酸二级结构含有3’端发卡结构。
17、本专利技术还提供了所述新型rna编辑组合物在基因编辑以及制备基因编辑试剂中的应用。
18、所述rna编辑组合物通过降解真核细胞中外源基因和内源基因mrna，并降低对应蛋白表达。所述降解是向目的基因的基因组rna和mrna引入的一个或多个单链断裂。
19、本专利技术还提供了所述新型rna编辑组合物在制备基因突变所致疾病的治疗药物中的应用，所述疾病包含阿尔茨海默病。
20、所述rna编辑组合物选自以下任意形式：taqtth-3'hprna组合物、taqtth-3’hpdna组合物、taqtth-3'hprna单质粒系统或aav-taqtth-3'hrna载体。
21、所述taqtth-3'hprna单质粒系统是基于重组腺相关病毒raav穿梭质粒改造的由cag启动子驱动分别表达egfp和taqtth蛋白并窜连u6启动子驱动表达靶向appswe的3’hprna单质粒。
22、所述aav-taqtth-3'hrna载体是将taqtth-3'hprna单质粒中的cag启动子替换成神经元特异性启动子syn，并通过血清型9的aav辅助质粒，将其包装成aav。
23、本专利技术所述rna编辑组合物应用于阿尔茨海默病干预时，将rna编辑组合物用aav载体递送，靶向粉样前体蛋白突变基因(appswe)，从而敲低appswe蛋白的生成，进而减少脑内β淀粉样蛋白(aβ)的产生；同时，不会误伤非致病野生型基因appwt，不影响正常功能；另外，利用新型rna编辑组合物体积小的优势，组装一个有利基因apoe2在同一个aav载体中，可以同时敲低突变appswe蛋白的表达水平，并且表达保护性apoe2基因。
24、本专利技术还提供了一种rna编辑组合物与apoe2串联构建的aav载体。在ha标记的taqtth下游克隆apoe2基因，两个蛋白间用t2a连接，利用血清型9的aav辅助质粒，将该载体包装成aav9，并命名为aav-taqtth-t-apoe2。
25、有益效果：
26、第一，本专利技术新型rna编辑组合物中的蛋白分子，比现有基因编辑工具中的蛋白分子量小得多，有利于aav载体的装载。
27、第二，本专利技术新型rna编辑组合物切割靶标底物时，不会受到靶标底物的序列限制。
28、第三，本专利技术新型rna编辑组合物没有附带切割活性，能区分单碱基差异靶标本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型RNA编辑组合物，其特征在于，该组合物包含：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组分(i)中，所述TaqTth蛋白选自以下任一种：
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述TaqTth蛋白为Thermus aquaticusDNA polymerase和Thermus thermophilus DNA polymerase中各一部分融合之后形成的一种嵌合功能蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述TaqTth蛋白分子在C端或N端含一个或多个核导出信号；所述编码TaqTth蛋白分子的多核苷酸为DNA或RNA。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组分(ii)中，所述寡核苷酸探针为化学合成的寡核苷酸探针，或插入质粒骨架构建成的质粒。
6.根据权利要求1或5所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸探针的核酸二级结构含有3’端发卡结构。
7.一种新型RNA编辑组合物在基因编辑
8.一种新型RNA编辑组合物在制备基因突变所致疾病的治疗药物中的应用，其特征在于，所述疾病包含阿尔茨海默病。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述RNA编辑组合物选自以下任意形式：TaqTth-3'hpRNA组合物、TaqTth-3’hpDNA组合物、TaqTth-3'hpRNA单质粒系统或AAV-TaqTth-3'hRNA载体；
10.一种RNA编辑组合物与APOE2串联构建的AAV载体，其特征在于，在HA标记的TaqTth下游克隆APOE2基因，两个蛋白间用T2A连接，利用血清型9的AAV辅助质粒，将该载体包装成AAV9，并命名为AAV-TaqTth-T-APOE2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
...【技术特征摘要】
1.一种新型rna编辑组合物，其特征在于，该组合物包含：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组分(i)中，所述taqtth蛋白选自以下任一种：
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述taqtth蛋白为thermus aquaticusdna polymerase和thermus thermophilus dna polymerase中各一部分融合之后形成的一种嵌合功能蛋白，其核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述taqtth蛋白分子在c端或n端含一个或多个核导出信号；所述编码taqtth蛋白分子的多核苷酸为dna或rna。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组分(ii)中，所述寡核苷酸探针为化学合成的寡核苷酸探针，或插入质粒骨架构建成的质粒。
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐澍，司马健，徐翀，强焕然，曹吉娅诺，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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