【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及临床医学检验，特别涉及一种超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
1、近红外二区(nir-ii)荧光具有发射波长较长(1000～1700nm)、组织穿透能力强、光散射和自体荧光干扰小等显著优点，能够有效避免生物样本(血液等)自发荧光干扰问题。在荧光免疫层析技术平台中选择使用近红外二区荧光作为检测信号可以降低背景干扰、减少信号衰减，从而进一步提高平台的分析性能。因此，发展荧光量子效率高、光稳定性好且表面易于修饰的高效近红外二区荧光探针成为提高荧光免疫层析技术平台分析性能的关键。
2、在众多nir-ii分子探针中，稀土纳米微球(renps)更是具有stokes位移较大(大于200nm)、荧光衰变寿命较长、量子产率较高以及表面易于修饰等特点，在荧光免疫层析技术平台中具有极大的应用优势和发展潜力。renps表面亲水化修饰过程是影响其发光性能的重要环节，目前采用的表面修饰方法主要有2种：(1)配体直接交换法利用不同配体和renps表面的结合力不同去除表面配体，比如硼酸盐(nabf4)和renps的结合力远高于羧化物，再加入亲水性聚合物(聚丙烯酸paa等)，通过加热反应获得表面羧基化修饰的亲水性renps-paa。然而，这种方法难以控制来自每个聚合物分子的所有结合基团均能有序地、选择性地附着在renps上。同时，renps表面羧基化修饰后，其表面的-cooh和-oh基团会引起镧系元素(掺杂元素和敏化剂)的非辐射弛豫增强效应，从而产生部分荧光猝灭现象。(2)酸洗法即首先使用稀盐酸溶
3、因此，如何发展新型高效renps表面修饰技术，使其避免或者尽量降低其表面修饰过程中的颗粒聚集现象以及引发的部分荧光猝灭效应成为亟待解决的问题，同时也是提高荧光免疫层析试剂分析性能的关键。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条及其制备方法。
2、本专利技术的第一方面在于提供一种超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)制备稀土纳米微球(renps)标记液，包括步骤：
4、s1、超分子主体化合物修饰稀土纳米微球；
5、s2、1-金刚烷甲酸钠(adcna)预活化；
6、s3、将s1制得的超分子主体化合物修饰的renps、s2制得的活化的adcna与抗体形成稀土纳米微球标记液；
7、(2)制备微球结合垫；
8、(3)制备样本垫；
9、(4)硝酸纤维素膜包被抗体；
10、(5)组装制卡。
11、其中，微球为稀土掺杂的近红外二区荧光纳米微球。
12、本专利技术提供一种超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，利用超分子主体化合物修饰增强的近红外二区荧光稀土纳米微球作为荧光探针，一方面利用超分子主体化合物表面修饰策略增强稀土纳米微球(renps)发光效应以降低颗粒聚集及荧光猝灭现象，另一方面超分子主体化合物修饰稀土纳米微球(renps)可以借助主客体自组装增加微球表面的抗体结合量，有效提高了抗体标记效率；在此基础上建立免疫层析方法并制备荧光免疫层析试剂条，能够更加灵敏准确地测定生物样本中痕量标志物浓度。
13、进一步，s3的步骤如下：
14、超分子主体化合物修饰的renps和活化的adcna自组装制得自组装复合物；
15、自组装复合物偶联抗体形成稀土纳米微球标记液。
16、进一步，s3的步骤如下：
17、adcna偶联抗体形成抗体复合物(adc-ab)；
18、超分子主体化合物修饰的renps与抗体复合物自组装形成稀土纳米微球标记液。
19、进一步，步骤(1)中，所述稀土纳米微球标记液的具体制备步骤如下：
20、取油酸配体修饰的renps(renps-oa)溶于氯仿，加入超分子主体化合物水溶液，室温搅拌过夜后，高速离心并用纯水洗涤，最后用纯水超声重悬得到超分子主体化合物修饰的renps溶液；
21、将1-金刚烷甲酸(adc)和naoh溶于乙醇，室温搅拌反应过夜后真空干燥获得1-金刚烷甲酸钠(adcna)，将一定量的adcna溶于mes缓冲液(2-(n-吗啉基)乙磺酸)，加入新鲜配制的edc溶液(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和sulfo-nhs溶液(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)，室温避光活化反应得到活化液；
22、在活化液中加入所述超分子主体化合物修饰的renps溶液，室温继续搅拌进行自组装反应，高速离心，弃上清，得到白色沉淀，用bbs(硼酸盐缓冲液，ph＝8.0)洗涤所述白色沉淀，再加入bbs超声重悬得到自组装复合物溶液；
23、将所述自组装复合物溶液加入到一定浓度的抗体溶液中，室温振荡反应2-3h，加入封闭液封闭，高速离心后用微球洗涤液清洗，加入微球保护液超声重悬，得到稀土纳米微球标记液，4℃保存，备用。
24、进一步，步骤(1)中，所述稀土纳米微球标记液的具体制备步骤如下：
25、取油酸配体修饰的renps溶于氯仿，加入超分子主体化合物水溶液，室温搅拌反应过夜后，高速离心并用纯水洗涤，最后用纯水超声重悬得到超分子主体化合物修饰的renps溶液；
26、将1-金刚烷甲酸(adc)和naoh溶于乙醇，室温搅拌反应过夜后真空干燥获得1-金刚烷甲酸钠(adcna)白色粉末，将一定量的adcna溶于mes缓冲液，加入新鲜配制的edc溶液和sulfo-nhs溶液，室温避光活化反应得到活化液；
27、将活化液和抗体溶于bbs缓冲液，加入新鲜配制的edc溶液和sulfo-nhs溶液，4℃搅拌反应过夜，离心过滤浓缩并分离抗体复合物(adc-ab)，紫外-可见分光光度法(uv-vis)测定adc-ab浓度；
28、超分子主体化合物修饰的renps溶液和adc-ab溶液混合，4℃搅拌反应过夜，加入封闭液封闭，高速离心用微球洗涤液清洗，加入微球保护液超声重悬，得到稀土纳米微球标记液，4℃保存，备用。
29、进一步，所述所述adc与edc、edc与sulfo-nhs的摩尔比均在1-10之间。
30、进一步，所述adc、edc、sulfo-nhs的摩尔比为1：5：10。
31、进一步，所述抗体添加量为50-200μg；所述封闭液为40mm乙醇胺溶液或10％的bsa溶液(牛血清清蛋白)；所述微球洗涤液为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，S3的步骤如下：
3.根据权利要求1所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，S3的步骤如下：
4.根据权利要求2所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述稀土纳米微球标记液的具体制备步骤如下：
5.根据权利要求3所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述稀土纳米微球标记液的具体制备步骤如下：
6.根据权利要求4或5所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述ADC与EDC、EDC与Sulfo-NHS的摩尔比均在1-10之间。
7.根据权利要求4或5所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所
8.一种超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条，其特征在于，通过权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条，其特征在于，所述免疫层析试纸条以超分子主体化合物增强近红外二区荧光的稀土纳米微球作为荧光探针标记抗体，所述稀土纳米微球的粒径为100～500nm。
10.根据权利要求9所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条，其特征在于，所述超分子主体化合物为环糊精(CD)、葫芦脲(CB)、冠醚(CE)、柱芳烃(PA)、杯芳烃(CA)中的任意一种或几种。
...【技术特征摘要】
1.一种超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，s3的步骤如下：
3.根据权利要求1所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，s3的步骤如下：
4.根据权利要求2所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述稀土纳米微球标记液的具体制备步骤如下：
5.根据权利要求3所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述稀土纳米微球标记液的具体制备步骤如下：
6.根据权利要求4或5所述的超分子主客体作用增强近红外二区荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述adc与edc、edc与sulfo-nhs的摩尔比均在1-10之间。
【专利技术属性】
技术研发人员：程震，宋兆瑞，
申请(专利权)人：烟台新药创制山东省实验室，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。