【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术与分子生物学及基因编辑领域有关。
技术介绍
1、靶向的基因组编辑或修饰正迅速成为基础及应用研究的重要工具。最初的方法涉及例如大范围核酸酶(meganuclease)、锌指融合蛋白或talen之类的工程核酸酶，需要产生具有对每一种特定目标序列专一的工程化、可编程、序列专一的dna结合结构域的嵌合核酸酶。rna引导的核酸酶(例如成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)-相关(cas)细菌系统的crispr-cas蛋白)通过将核酸酶与引导rna(引导rna与特定目标序列专一性杂交)复合而允许靶向专一性序列。相较于为每一个目标序列产生嵌合核酸酶，产生目标专一性引导rna的成本更低且更有效。这种rna引导的核酸酶可用于选择性地经由序列专一性双链断裂的引入来编辑基因组，所述断裂经由易错的非同源末端连接(nhej)修复以在特定基因组位置引入突变。替代地，可以经由同源定向修复(homology-directed repair)将异源dna引入基因组位点。当与脱氨酶融合时，rna引导的核酸酶(rgn)也可用于碱基编辑。
技术实现思路
1、提供了用于结合所关注的目标序列的组合物及方法。组合物可用于切割或修饰所关注的目标序列、检测所关注的目标序列，以及修饰所关注的序列的表达。组合物包括rna引导的核酸酶(rgn)多肽、crispr rna(crrna)、转录激活的crispr rna(tracrrna)、引导rna(grna)、编码所述rgn多肽、crrna、tracrrna、grna的核
2、在第一方面中，本公开提供一种核酸分子，其包括编码rna引导的核酸酶(rgn)多肽的多核苷酸，其中多核苷酸包括编码rgn多肽的核苷酸序列，rgn多肽包括与seq id no:1-12中任一个具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；其中，当与能够与目标dna序列杂交的引导rna(grna)结合时，rgn多肽能够以rna引导的序列专一性方式结合目标dna序列。在一些实施例中，rgn多肽包括与seq id no:6具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。在上述方面的一些实施例中，rgn多肽包括与seq id no:1-12中任一个具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，rgn多肽包括与seq id no:6具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列。
3、在上述方面的一些实施例中，编码rgn多肽的多核苷酸可操作地连接于与多核苷酸异源的启动子。
4、在上述方面的一些实施例中，rgn多肽能够于结合时切割目标dna序列。
5、在上述方面的一些实施例中，rgn多肽能够产生双链断裂。
6、在上述方面的一些实施例中，rgn多肽能够产生单链断裂。
7、在上述方面的一些实施例中，rgn多肽为无核酸酶活性的或为切口酶。
8、在上述方面的一些实施例中，rgn多肽可操作地连接于先导编辑(prime editing)多肽。在一些实施例中，先导编辑多肽包括dna聚合酶。在一些实施例中，先导编辑多肽包括反转录酶。在上述方面的一些实施例中，rgn多肽可操作地连接于碱基编辑多肽。在一些实施例中，碱基编辑多肽为脱氨酶。在一些实施例中，脱氨酶与seq id no:377-448中任一个的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。在上述方面的一些实施例中，脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。在一些实施例中，脱氨酶与seq id no:377-448中任一个的氨基酸序列具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
9、在上述方面的一些实施例中，rgn多肽包括一个或多个核定位信号。
10、在上述方面的一些实施例中，rgn多肽针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。
11、在上述方面的一些实施例中，目标dna序列被定位为与前间隔序列邻近基序(pam)相邻。
12、在另一方面中，本公开提供一种载体，其包括上文描述的核酸分子。
13、在上述方面的一些实施例中，载体进一步包括编码能够与目标dna序列杂交的grna的至少一个核苷酸序列。
14、在上述方面的一些实施例中，引导rna选自由下列所组成的群组：a)包括crisprrna及tracrrna的引导rna，crispr rna包括与seq id no:13具有至少90％序列一致性的crispr重复序列，tracrrna与seq id no:25具有至少90％序列一致性，其中rgn多肽包括与seq id no:1具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；b)包括crispr rna及tracrrna的引导rna，crispr rna包括与seq id no:14具有至少90％序列一致性的crispr重复序列，tracrrna与seq id no:26具有至少90％序列一致性，其中rgn多肽包括与seq id no:2具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；c)包括crispr rna及tracrrna的引导rna，crispr rna包括与seq id no:15具有至少90％序列一致性的crispr重复序列，tracrrna与seq id no:27具有至少90％序列一致性，其中rgn多肽包括与seq id no:3具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；d)包括crispr rna及tracrrna的引导rna，crispr rna包括与seq id no:16具有至少90％序列一致性的crispr重复序列，tracrrna与seq id no:28具有至少90％序列一致性，其中rgn多肽包括与seq id no:4具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；e)包括crispr rna及tracrrna的引导rna，crispr rna包括与seq id no:17具有至少90％序列一致性的crispr重复序列，tracrrna与seq id no:29具有至少90％序列一致性，其中rgn多肽包括与seq id no:5具有至少90％序列一致性的氨基酸序列；f)包括crispr rna及tracrrna的引导rna，crispr rna包括与seq id no:18具有至少90％序列一致性的crispr重复序列，tracrrna与seq id no:30具有至本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸分子，其包括编码RNA引导的核酸酶（RGN）多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码RGN多肽的核苷酸序列，所述RGN多肽包括与SEQ ID NO: 1-12中任一个具有至少90%序列一致性的氨基酸序列；
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述RGN多肽包括与SEQ ID NO: 1-12中任一个具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中编码RGN多肽的所述多核苷酸可操作地连接于与所述多核苷酸异源的启动子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽能够于结合时切割所述目标DNA序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述RGN多肽能够产生双链断裂。
6.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述RGN多肽能够产生单链断裂。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽为无核酸酶活性的或为切口酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述先导编辑多肽包括DNA聚合酶。
10.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述先导编辑多肽包括反转录酶。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽可操作地连接于碱基编辑多肽。
12.根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
14.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述脱氨酶与SEQ ID NO: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少90%序列一致性。
15.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述脱氨酶与SEQ ID NO: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽包括一个或多个核定位信号。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的核酸分子，其中所述目标DNA序列被定位为与前间隔序列邻近基序（PAM）相邻。
19.一种载体，其包括根据权利要求1至18中任一项所述的核酸分子。
20.根据权利要求19所述的载体，其进一步包括编码能够与所述目标DNA序列杂交的所述gRNA的至少一个核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的载体，其中所述引导RNA选自由下列所组成的群组：
22.根据权利要求20所述的载体，其中所述引导RNA选自由下列所组成的群组：
23.根据权利要求20或21所述的载体，其中所述gRNA为单引导RNA。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述sgRNA进一步包括延伸，所述延伸包括用于先导编辑的编辑模板。
25.根据权利要求20或21所述的载体，其中所述gRNA为双引导RNA。
26.一种细胞，其包括根据权利要求1至18中任一项所述的核酸分子或根据权利要求19至25中任一项所述的载体。
27.一种用于制造RGN多肽的方法，其包括：在所述RGN多肽表达的条件下，培养根据权利要求26所述的细胞。
28.一种用于制造RGN多肽的方法，其包括将异源核酸分子引入细胞内，所述异源核酸分子包括编码RNA引导的核酸酶（RGN）多肽的核苷酸序列，所述RGN多肽包括与SEQ ID NO:1-12中任一个具有至少90%序列一致性的氨基酸序列；
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述RGN多肽包括与SEQ ID NO: 1-12中任一个具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的氨基酸序列。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其进一步包括纯化所述RGN多肽。
31.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步表达一个或多个引导RNA，所述一个或多个引导RNA能够与所述RGN多肽结合以形成RGN核糖核蛋白复合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括纯化所述RGN核糖核蛋白复合物。
33.一种RNA...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种核酸分子，其包括编码rna引导的核酸酶（rgn）多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码rgn多肽的核苷酸序列，所述rgn多肽包括与seq id no: 1-12中任一个具有至少90%序列一致性的氨基酸序列；
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述rgn多肽包括与seq id no: 1-12中任一个具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中编码rgn多肽的所述多核苷酸可操作地连接于与所述多核苷酸异源的启动子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述rgn多肽能够于结合时切割所述目标dna序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述rgn多肽能够产生双链断裂。
6.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述rgn多肽能够产生单链断裂。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述rgn多肽为无核酸酶活性的或为切口酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述rgn多肽可操作地连接于一先导编辑多肽。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述先导编辑多肽包括dna聚合酶。
10.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述先导编辑多肽包括反转录酶。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述rgn多肽可操作地连接于碱基编辑多肽。
12.根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
14.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述脱氨酶与seq id no: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少90%序列一致性。
15.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述脱氨酶与seq id no: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述rgn多肽包括一个或多个核定位信号。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的核酸分子，其中所述rgn多肽针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的核酸分子，其中所述目标dna序列被定位为与前间隔序列邻近基序（pam）相邻。
19.一种载体，其包括根据权利要求1至18中任一项所述的核酸分子。
20.根据权利要求19所述的载体，其进一步包括编码能够与所述目标dna序列杂交的所述grna的至少一个核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的载体，其中所述引导rna选自由下列所组成的群组：
22.根据权利要求20所述的载体，其中所述引导rna选自由下列所组成的群组：
23.根据权利要求20或21所述的载体，其中所述grna为单引导rna。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述sgrna进一步包括延伸，所述延伸包括用于先导编辑的编辑模板。
25.根据权利要求20或21所述的载体，其中所述grna为双引导rna。
26.一种细胞，其包括根据权利要求1至18中任一项所述的核酸分子或根据权利要求19至25中任一项所述的载体。
27.一种用于制造rgn多肽的方法，其包括：在所述rgn多肽表达的条件下，培养根据权利要求26所述的细胞。
28.一种用于制造rgn多肽的方法，其包括将异源核酸分子引入细胞内，所述异源核酸分子包括编码rna引导的核酸酶（rgn）多肽的核苷酸序列，所述rgn多肽包括与seq id no:1-12中任一个具有至少90%序列一致性的氨基酸序列；
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述rgn多肽包括与seq id no: 1-12中任一个具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的氨基酸序列。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其进一步包括纯化所述rgn多肽。
31.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步表达一个或多个引导rna，所述一个或多个引导rna能够与所述rgn多肽结合以形成rgn核糖核蛋白复合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括纯化所述rgn核糖核蛋白复合物。
33.一种rna引导的核酸酶（rgn）多肽，其中所述rgn多肽包括与seq id no: 1-12中任一个具有至少90%序列一致性的氨基酸序列；以及
34.根据权利要求33所述的rgn多肽，其中所述rgn多肽包括与seq id no: 1-12中任一个具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的氨基酸序列。
35.根据权利要求33或34所述的rgn多肽，其中所述rgn多肽为分离的rgn多肽。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的rgn多肽，其中所述rgn多肽能够于结合时切割所述目标dna序列。
37.根据权利要求36所述的rgn多肽，其中由所述rgn多肽的切割产生双链断裂。
38.根据权利要求36所述的rgn多肽，其中由所述rgn多肽的切割产生单链断裂。
39.根据权利要求33至35中任一项所述的rgn多肽，其中所述rgn多肽为无核酸酶活性的或为切口酶。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的rgn多肽，其中所述rgn多肽可操作地连接于先导编辑多肽。
41.根据权利要求40所述的rgn多肽，其中所述先导编辑多肽包括dna聚合酶。
42.根据权利要求40所述的rgn多肽，其中所述先导编辑多肽包括反转录酶。
43.根据权利要求33至39中任一项所述的rgn多肽，其中所述rgn多肽可操作地连接于碱基编辑多肽。
44.根据权利要求43所述的rgn多肽，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。
45.根据权利要求44所述的rgn多肽，其中所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
46.根据权利要求44所述的rgn多肽，其中所述脱氨酶与seq id no: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少90%序列一致性。
47.根据权利要求44所述的rgn多肽，其中所述脱氨酶与seq id no: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。
48.根据权利要求33至47中任一项所述的rgn多肽，其中所述目标dna序列被定位为与前间隔序列邻近基序（pam）相邻。
49.根据权利要求33至48中任一项所述的rgn多肽，其中所述rgn多肽包括一个或多个核定位信号。
50.一种核糖核蛋白（rnp）复合物，其包括根据权利要求33至49中任一项所述的rgn多肽，以及与所述rgn多肽结合的所述引导rna。
51.一种用于结合dna分子的目标dna序列的系统，所述系统包括：
52.根据权利要求51所述的系统，其中编码所述rgn多肽的所述核苷酸序列，以及编码所述一个或多个引导rna的所述核苷酸序列中的至少一个可操作地连接于与所述核苷酸序列异源的启动子。
53.根据权利要求51或52所述的系统，其中编码所述一个或多个引导rna的所述核苷酸序列，以及编码所述rgn多肽的所述核苷酸序列位于一个载体上。
54.一种用于结合dna分子的目标dna序列的系统，所述系统包括：
55.根据权利要求51至54中任一项所述的系统，其中所述rgn多肽包括与seq id no:1-12中任一个具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的氨基酸序列。
56.根据权利要求51至55中任一项所述的系统，其中编码所述一个或多个引导rna的所述核苷酸序列中的至少一个可操作地连接于与所述核苷酸序列异源的启动子。
57.根据权利要求51至56中任一项所述的系统，其中在自然界中未发现所述rgn多肽与所述一个或多个引导rna彼此复合。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的系统，其中所述目标dna序列为真核目标dna序列。
59.根据权利要求51至58中任一项所述的系统，其中所述grna为单引导rna（sgrna）。
60.根据权利要求59所述的系统，其中所述sgrna进一步包括延伸，所述延伸包括用于先导编辑的编辑模板。
61.根据权利要求51至58中任一项所述的系统，其中所述grna为双引导rna。
62.根据权利要求51至61中任一项所述的系统，其中所述grna选自由下列所组成的群组：
63.根据权利要求51至61中任一项所述的系统，其中所述grna选自由下列所组成的群组：
64.根据权利要求51至63中任一项所述的系统，其中所述目标dna序列被定位为与前间隔序列邻近基序（pam）相邻。
65.根据权利要求51至64中任一项所述的系统，其中所述目标dna序列在细胞内。
66.根据权利要求51至65中任一项所述的系统，其中所述一个或多个引导rna能够与所述目标dna序列杂交，并且所述引导rna能够与所述rgn多肽形成复合物，以引导所述目标dna序列的切割。
67.根据权利要求66所述的系统，其中所述切割产生双链断裂。
68.根据权利要求66所述的系统，其中所述切割产生单链断裂。
69.根据权利要求51至65中任一项所述的系统，其中所述rgn多肽为无核酸酶活性的或为切口酶。
70.根据权利要求51至69中任一项所述的系统，其中所述rgn多肽可操作地连接于先导编辑多肽。
71.根据权利要求70所述的系统，其中所述先导编辑多肽包括dna聚合酶。
72.根据权利要求70所述的系统，其中所述先导编辑多肽包括反转录酶。
73.根据权利要求51至69中任一项所述的系统，其中所述rgn多肽可操作地连接于碱基编辑多肽。
74.根据权利要求73所述的系统，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。
75.根据权利要求74所述的系统，其中所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
76.根据权利要求74所述的系统，其中所述脱氨酶与seq id no: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少90%序列一致性。
77.根据权利要求74所述的系统，其中所述脱氨酶与seq id no: 377-448中任一个的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。
78.根据权利要求51...
【专利技术属性】
技术研发人员：G·H·阿里亚，M·寇伊勒，A·B·克拉维利，T·D·埃里驰，J·S·帕克，
申请(专利权)人：生命编辑制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。