【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及一种利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株的方法及其应用。
技术介绍
1、原儿茶酸也称为3,4-二羟基苯甲酸，是具有独特生理活性及药理特性的次级代谢产物。针对不同的分子靶点，原儿茶酸具有多种多样的生物活性：可预防一些慢性变性、心血管和神经退行性疾病；可作为一种新型合成多聚物和塑料的组成部分；具有良好的电化学活性的与多糖物质结合的复合物；可合成生物塑料；在药理特性上具有抗菌、抗炎、抗氧化、防衰老等作用，还可潜在地用于药物和功能食品中。基于原儿茶酸的优异特性，其在医药、饲料、环保等领域的需求量不断增长，具有十分明显的生产意义。
2、转座子突变菌株技术是在合成生物学和代谢工程领域常用的菌株构建策略之一。通过将目标基因和抗性基因放置于转座子识别序列内，通过抗性筛选可以快速获得目标基因整合的菌株。基于相关技术的生物合成原儿茶酸菌株缺乏高通量筛选方法是系统优化其合成途径的主要挑战。此外，转座子抗性的残留问题也为菌株带来额外的代谢负担，在工业应用时同时面临抗性基因水平转移而逃逸的坏境的潜在风险。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提供一种利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株的方法及其应用。该方法采用生物传感器实时动态的响应目标产物的实际产量，可快速高效地筛选出高产菌株。
2、为此，在本专利技术的一方面，本专利技术提出了一种利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株
3、在目标宿主中构建响应生物传感器控制表达报告基因和抗性基因的质粒；
4、将目标产物的合成模块通过转座系统随机整合至所述目标宿主的基因组；
5、将所述目标宿主在对应抗性的平板上筛选具有耐受性的菌落，挑选报告基因输出强度高的菌落，以指向性的筛选高产目标产物的宿主菌株。
6、根据本专利技术的一种利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株的方法，该方法采用生物传感器实时动态的响应目标产物的实际产量，从而快速高效地筛选出高产菌株。由于生物传感器响应可直接目标产物，因此产物合成模块可以在无抗性的转座子系统直接使用，使得获得改造后的菌株在移除生物传感器质粒后不带任何抗性筛选标签，从而在下游工业应用方面可以消除抗性基因带来的代谢负担。
7、另外，根据本专利技术上述实施例提出利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
8、可选地，所述目标产物为原儿茶酸。
9、进一步，所述目标宿主为恶臭假单胞菌，也可以是其他底盘细胞。
10、进一步，所述生物传感器为来自天蓝色链霉菌的原儿茶酸响应系统，该相应系统是pcav作为阻遏蛋白，在原儿茶酸的作用下解除plv启动子的抑制，开启下游基因表达。根据目标产物的不同，生物传感器模块的选择也可以是响应其他目标产物的系统。
11、进一步，所述报告基因为绿色荧光蛋白egfp，所述抗性基因为庆大霉素抗性基因gm。报告基因和抗性基因可以是与目标宿主适配的其他基因。
12、可选地，所述转座系统为非复制型tn5转座系统，所述转座系统移除了抗性筛选标签，其中转座系统内包含了目标产物合成所需的基因。转座系统也可以是himar1、piggybac等
13、进一步，将所述目标宿主在庆大霉素抗性平板上筛选，挑选绿色荧光蛋白信号强的菌落，以指向性的筛选高产目标产物的宿主菌株。筛选方式也可是流式细胞术或微流控等高通量筛选技术。
14、可选地，该方法包括以下步骤：
15、将核苷酸序列如seq id no:1所示的合成序列pcav-plv-egdp-gm载体通过ecori-hindiii切割，与ecori-hindiii切割后的prk415载体连接，获得原儿茶酸响应质粒prk415-pcav-plv-egdp-gm；
16、将所述原儿茶酸响应质粒prk415-pcav-plv-egdp-gm电转化转入恶臭假单胞菌感受态细胞，获得原儿茶酸响应菌株；
17、将核苷酸序列如seq id no:2所示的prl27-tn5转座载体通过bamhi-xhoi切割，与bamhi-xhoi切割后的核苷酸序列如seq id no:3所示的原儿茶酸合成模块asbf-arogfbr连接，获得转座质粒prl27-tn5-asbf-arogfbr-tn5；
18、将所述转座质粒prl27-tn5-asbf-arogfbr-tn5电转化转入所述原儿茶酸响应菌株，在庆大霉素抗性平板上筛选，挑选绿色荧光蛋白信号强的菌落，以指向性的筛选原儿茶酸高产菌株。
19、由此，高产菌株可以通过生物传感器响应模块，在原儿茶酸产生的情况下，解除pcav对启动子plv的抑制开启下游基因egfp，gm的表达。由于tn5转座系统的随机性，在生物传感器的协助下，能够具有指向性的筛选无抗性转座高产菌株。相较于传统转座系统而言，由于抗性标签种类的限制，大多数转座的次数受到限制，且需要大量的筛选工作以获得高产菌株。因此，利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株的方法在实际生产应用中更具竞争力。
20、在恶臭假单胞菌中构建原儿茶酸响应模块pcav-plv-egfp-gm，原儿茶酸生产模块asbf-arogfbr通过tn5转座系统随机插入到恶臭假单胞菌基因组中；一旦转座发挥作用，恶臭假单胞菌生产的原儿茶酸就会被自身的原儿茶酸传感器所响应，表达egfp及gm抗性。与传统转座系统盲目的筛选不同，该方法只需在庆大霉素平板上筛选强荧光信号的菌株，就可指向性的筛选高产原儿茶酸的菌株，除此外，传感器间接筛选使得转座系统无需抗生素标记，这为传统转座方法如何高效筛选提供了一种新思路。
21、在本专利技术的第二个方面，本专利技术提出了由上述方法筛选制得原儿茶酸高产菌株。
22、在本专利技术的第三个方面，本专利技术提出上述原儿茶酸高产菌株在原儿茶酸生物合成中的应用。
23、本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
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1.一种利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株的方法，其特征在于，包括：
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标产物为原儿茶酸。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标宿主为恶臭假单胞菌。
4.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物传感器为来自天蓝色链霉菌的原儿茶酸响应系统。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述报告基因为绿色荧光蛋白eGFP，所述抗性基因为庆大霉素抗性基因Gm。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座系统为非复制型Tn5转座系统，所述转座系统移除了抗性筛选标签。
7.权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述目标宿主在庆大霉素抗性平板上筛选，挑选绿色荧光蛋白信号强的菌落，以指向性的筛选高产目标产物的宿主菌株。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求1-8中任一所述的方法筛选制得原儿茶酸高产菌株。
10.权利要求9所述中原儿茶酸高产菌株在原儿茶酸生物合成中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种利用生物传感器辅助转座子工程筛选高产菌株的方法，其特征在于，包括：
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标产物为原儿茶酸。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标宿主为恶臭假单胞菌。
4.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物传感器为来自天蓝色链霉菌的原儿茶酸响应系统。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述报告基因为绿色荧光蛋白egfp，所述抗性基因为庆大霉素抗性基因gm。
6.权利要...
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