【技术实现步骤摘要】
本申请涉及动物繁殖，更具体地说，它涉及抑制opa1活性的表达用于降低体外培养卵母细胞质量的方法和应用。
技术介绍
1、近年来，活体采卵-体外胚胎生产（opu-ivp）技术越来越多地应用到肉牛的繁殖生产当中，利用opu-ivp技术可以大大缩短肉牛的繁殖周期，使肉牛繁殖效率得到极大提高。而通过ivp获得胚胎的基础是卵母细胞体外成熟（ivm）技术，但是ivm获得的成熟卵母细胞质量不尽如人意。因此，改善卵母细胞ivm的质量十分重要。线粒体为卵母细胞成熟过程中的各种生物进程提供能量，在卵母细胞成熟过程中起着十分重要的作用，线粒体的功能与卵母细胞质量息息相关。
2、自噬是一种基因编程过程，可去除不必要或功能失调的细胞成分并回收。最初，自噬被定义为非选择性途径，但现在人们普遍认为有选择性和非选择性两种不同的自噬途径。当营养缺乏时，主要激活非选择性自噬，为细胞提供营养物质。而在营养丰富的条件下，选择性自噬是活跃的，主要负责清除功能失调的细胞器及细胞内病原体等。细胞遇到各种应激会导致线粒体功能失调。为了维持细胞内环境稳态以及线粒体网络的健康，细胞启动自噬机制降解受损线粒体，这一过程称为线粒体自噬。
3、线粒体自噬的途径主要分为两种：泛素依赖途径和非泛素依赖途径。泛素依赖途径的关键蛋白是pink-1和parkin，因此也称为pink-1/parkin通路。线粒体受损表现为膜电位降低，pink-1在线粒体表面积累并稳定后，通过自磷酸化而被激活，进而招募胞质中parkin到线粒体表面并激活e3泛素连接酶，随后parkin使omm
4、卵母细胞成熟涉及多个过程，如纺锤体组装、染色体排列和细胞器重排等，这些过程都需要线粒体提供能量支持。已知线粒体动力学伴随着卵母细胞减数分裂进程，imm蛋白opa1对于线粒体动力学是至关重要的。但是，opa1对于牛卵母细胞成熟的影响鲜有报道。因此，首先探究opa1在牛卵母细胞成熟过程中的表达和定位。然后使用opa1特异性抑制剂myls22抑制opa1活性，以探究opa1在牛卵母细胞成熟过程中的线粒体功能、线粒体动力学、细胞凋亡和自噬中的作用。
技术实现思路
1、本专利技术提供了抑制opa1活性的表达用于降低体外培养卵母细胞质量的方法和应用。opa1在牛卵母细胞减数分裂不同阶段均有表达，抑制opa1导致牛卵母细胞第一极体排出率降低，破坏纺锤体结构，对线粒体方面的研究发现抑制opa1导致线粒体功能紊乱，促进线粒体分裂，并通过pink-1/parkin通路诱导线粒体自噬。
2、第一方面，本专利技术提供抑制opa1活性的表达在制备用于降低体外培养卵母细胞质量中的应用。
3、优选的，所述抑制opa1活性的表达具体通过pink-1/parkin通路诱导牛卵母细胞线粒体自噬。
4、优选的，抑制opa1活性的表达为opa1特异性抑制剂myls22，将卵母细胞在含有抑制剂myls22的体外培养液中进行培养，opa1特异性抑制剂myls22的体外培养液浓度为0 μm-60 μm。
5、第二方面，本专利技术提供一种牛卵母细胞体外成熟液，含有所述opa1特异性抑制剂myls22，所述opa1特异性抑制剂在牛卵母细胞gv、pre-mi、mi和mii期mrna以及蛋白表达。
6、优选的，所述opa1特异性抑制剂myls22的体外培养液浓度为0 μm-60 μm。
7、优选的，所述opa1特异性抑制剂myls22的体外培养液浓度为40 μm。
8、优选的，所述牛卵母细胞体外成熟液以nahco3缓冲过的tcm-199培养液为基础，还含有体积分数为10％的胎牛血清、1％的青霉素和链霉素混合液、0.022 g/ml丙酮酸钠、0.9mg/ml半胱氨酸、1 mg/ml雌二醇、10 ng/ml表皮生长因子、0.04 mg/ml卵泡刺激素。
9、第三方面，本专利技术提供一种降低体外成熟后的卵母细胞质量的方法，将牛卵母细胞加入到所述卵母细胞体外成熟培养液进行培养。
10、优选的，卵母细胞体外成熟需在co2培养箱中38.5 ℃，5% co2条件下培养22-24 h。
11、综上所述，本申请具有以下效果：
12、1、本专利技术中抑制opa1会影响牛卵母细胞成熟，损害线粒体功能，破坏线粒体动力学稳态，通过pink-1/parkin通路诱导线粒体自噬的发生；
13、2、本专利技术中抑制opa1会促进parkin募集到线粒体上，抑制opa1会通过pink-1/parkin途径激活线粒体自噬，抑制opa1会增加lc3蛋白表达量，增加牛卵母细胞溶酶体含量；
14、3、本专利技术opa1对牛卵母细胞成熟至关重要，抑制opa1导致牛卵母细胞线粒体功能障碍，诱导线粒体分裂，并通过pink-1/parkin通路诱导线粒体自噬。
15、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开的保护范围。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.抑制OPA1活性的表达在制备用于降低体外培养卵母细胞质量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制OPA1活性的表达具体通过PINK-1/Parkin通路诱导牛卵母细胞线粒体自噬。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制OPA1活性的表达为OPA1特异性抑制剂MYLS22，将卵母细胞在含有抑制剂MYLS22的体外培养液中进行培养，OPA1特异性抑制剂MYLS22的体外培养液浓度为0 μM-60 μM。
4.一种牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，含有权利要求3所述OPA1特异性抑制剂MYLS22，所述OPA1特异性抑制剂在牛卵母细胞GV、pre-MI、MI和MII期mRNA以及蛋白表达。
5.根据权利要求4所述的牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述OPA1特异性抑制剂MYLS22的体外培养液浓度为0 μM-60 μM。
6.根据权利要求4所述的牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述OPA1特异性抑制剂MYLS22的体外培养液浓度为40 μM。
7.根据权利要求4所述的牛卵母细胞
8.一种降低体外成熟后的卵母细胞质量的方法，其特征在于，将牛卵母细胞加入到权利要求4-7中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液进行培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，卵母细胞体外成熟需在CO2培养箱中38.5℃，5% CO2条件下培养22-24 h。
...【技术特征摘要】
1.抑制opa1活性的表达在制备用于降低体外培养卵母细胞质量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制opa1活性的表达具体通过pink-1/parkin通路诱导牛卵母细胞线粒体自噬。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制opa1活性的表达为opa1特异性抑制剂myls22，将卵母细胞在含有抑制剂myls22的体外培养液中进行培养，opa1特异性抑制剂myls22的体外培养液浓度为0 μm-60 μm。
4.一种牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，含有权利要求3所述opa1特异性抑制剂myls22，所述opa1特异性抑制剂在牛卵母细胞gv、pre-mi、mi和mii期mrna以及蛋白表达。
5.根据权利要求4所述的牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述opa1特异性抑制剂myls22的体外培养液浓度为0 μ...
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