【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及青霉素g扩环酶突变体及多核苷酸、表达载体、用途。
技术介绍
1、头孢菌素类抗生素是临床上广泛使用的一种抗生素，对细菌的选择作用强，而对人几乎没有毒性，具有抗菌谱广、抗菌作用强、耐青霉素酶、过敏反应较青霉素类少见等优点，市场应用量极大。7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸（7-adca）是重要的头孢菌素类抗生素合成的母核之一，作为半合成头孢类抗生素的重要中间体，需求量逐渐增加。
2、目前在工业上生产 7-adca 的方法主要有两种：分别是化学酶法和发酵法。化学酶法制备7-adca以青霉素g为原料，采用化学法氧化、扩环、重排后得到苯乙酰-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸（g-7-adca），然后在青霉素酰化酶作用下去除侧链得到7-adca，该方法具有成本高昂且环境不友好的缺点，随着工业工艺的进一步发展，该方法已被逐渐淘汰。工业上生产 7-adca 还可以使用发酵法，在1995年的一篇报道中首次预言到有酶能将青霉素g的五元环变成g-7-adca的六元环，在此后不久的1998年，cho及其同事发现了扩环酶（daocs）能催化这一反应，使理论上的方法成为了现实。目前工业上常用的方法是将扩环酶基因克隆到假单胞菌、产黄青霉菌或棒状链霉菌中，通过外源添加苯乙酸、盐或酯为底物，一步发酵得到g-7-adca，随后，g-7-adca在酰基转移酶的催化作用下，脱去苯乙酰基侧链得到7-adca。
3、全酶法制备7-adca具有绿色环保、成本低等优点。全酶法从廉价的青霉素g盐出发，经青霉素g扩环酶的催化扩
4、。
5、青霉素酰化酶的研究已经很成熟，且已经在工业上应用了很多年。现在用的较多的是固定化的青霉素酰化酶，而扩环酶的活性较低，在从青霉素g合成7-adca的路径中是限速步骤。因此，迫切需要提高扩环酶的可用性和活性。
6、青霉素g扩环酶（daocs），也称为脱乙酰氧基头孢菌素c合成酶，在fe2+、o2和α-酮戊二酸存在的情况下发挥作用，主要催化青霉素的五元噻唑环向六元噻嗪环的转化，是催化棒状链霉菌和其他原核生物合成头孢类抗生素的关键步骤，此反应不需要外源添加苯乙酸等易制毒化学品为底物，同时也对环境友好，因此daocs具有重要的工业应用价值。但在实际应用中，发现daocs对催化青霉素g的生物活性较低，无法满足工业应用，这成为了使用全酶法合成7-adca的限速步骤。因此，迫切需要对扩环酶进行改造，以期能够大幅提高其对青霉素g的转化效率，为工业应用莫定基础。目前来源于棒状链霉菌的scdaocs已经获得了晶体结构，其氨基酸序列如序列表seq id no.19（wt-scdaocs）所示，核苷酸序列如序列表seqid no.20所示，这使得通过蛋白质工程技术改造scdaocs，提高其催化活性、拓宽其底物谱成为可能，为酶法生产7-adca提供了广阔的工业应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供青霉素g扩环酶的突变体，这些突变体是在亲本多肽的一个或多个位置处进行了取代，与其亲本相比活性具有明显改善。本专利技术还同时提供了编码这些突变体的基因、核酸构建体、载体、宿主细胞，及突变体的用途等。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：青霉素g扩环酶的突变体，该突变体是在seq id no.19所示氨基酸序列上具有r27m点突变的突变体。
3、优选地，所述突变体还包含以下一个或多个位置的点突变：l50v、m73t、r139k、y184h、y217a、r249a和t292a。
4、本专利技术还提供了编码所述突变体的多核苷酸。
5、本专利技术进一步提供了包含所述多核苷酸的表达载体，所述表达载体用于在一个表达宿主中编码产生所述的一个或多个突变体。
6、本专利技术还进一步提供了包含所述表达载体的重组宿主细胞。
7、本专利技术还进一步提供过了所述突变体的用途，该突变体用于以青霉素g为原料合成苯乙酰-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸（g-7-adca）。
8、本专利技术还进一步提供了一种青霉素g扩环组合物，所述组合物中包含所述的突变体、所述的表达载体或者所述的重组宿主细胞。
9、本专利技术还进一步提供了所述突变体的制备方法，该方法包括：对所述的重组宿主细胞培养，并回收突变体。
10、本专利技术还进一步提供了利用所述突变体制备苯乙酰-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的方法，该方法以青霉素g为原料，反应体系中添加所述的突变体、重组宿主细胞培养物或发酵液，反应1.5-2h。
11、本专利技术提供的突变体催化青霉素g转化为g-7-adca的转化率比野生型明显提高，具有较好的应用前景；本专利技术还构建了扩环酶突变体表达库，相比野生型扩环酶，酶活力得到了较大的提升，具有广阔的应用前景。
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1.青霉素G扩环酶突变体，其特征在于：该突变体是序列表SEQ ID NO.19所示氨基酸序列上具有R27M点突变的突变体。
2.根据权利要求1所述的青霉素G扩环酶突变体，其特征在于：所述突变体还包含以下一个或多个位置的点突变L50V、M73T、R139K、Y184H、Y217A、R249A和T292A。
3.编码权利要求1或2所述突变体的多核苷酸。
4.一种包含权利要求3所述多核苷酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体用于在一个表达宿主中编码产生如权利要求1或2所述的一个或多个突变体。
5.一种包含权利要求4所述表达载体的重组宿主细胞。
6.权利要求1或2所述突变体的用途，其特征在于：该突变体用于以青霉素G为原料合成苯乙酰-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸。
7.一种青霉素G扩环组合物，其特征在于：所述组合物中包含权利要求1或2所述的突变体、权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的重组宿主细胞。
8.一种权利要求1或2所述突变体的制备方法，其特征在于：对权利要求5所述的重组宿主细胞培养后回收突
9.一种合成苯乙酰-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的方法，其特征在于：该方法以青霉素G为原料，在反应体系中添加权利要求1或2所述的突变体，或者权利要求5所述的重组宿主细胞的培养物或发酵液，反应1.5-2h。
...【技术特征摘要】
1.青霉素g扩环酶突变体，其特征在于：该突变体是序列表seq id no.19所示氨基酸序列上具有r27m点突变的突变体。
2.根据权利要求1所述的青霉素g扩环酶突变体，其特征在于：所述突变体还包含以下一个或多个位置的点突变l50v、m73t、r139k、y184h、y217a、r249a和t292a。
3.编码权利要求1或2所述突变体的多核苷酸。
4.一种包含权利要求3所述多核苷酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体用于在一个表达宿主中编码产生如权利要求1或2所述的一个或多个突变体。
5.一种包含权利要求4所述表达载体的重组宿主细胞。
6.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭友兵，马静，彭泽昊，杨东彦，董也，
申请(专利权)人：河北凯恩利生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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