【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，尤其是涉及一种金黄色葡萄球菌的重组聚合酶扩增引物及检测方法。
技术介绍
1、传统的病原菌微生物检测方法需要对病原菌进行分离、培养，并进行一系列的生化鉴定，操作繁琐，检测时间长，且无法适用于难以培养的病原菌，远不能满足临床实际需求。近年来，科研人员运用分子生物学及生物技术的最新成果，开发或优化了一系列新的细菌的快速检测技术，如pcr技术、基因芯片技术、酶联免疫技术、噬菌体技术、流式细胞技术及生物传感技术等。其中，流式细胞术具有检测速度快、精度高等特点，在细菌鉴定方面独具优势，已经成为细菌病理及微生物研究的重要手段。通过标记细菌的核酸或蛋白，可以快速、准确地检测样本中的细菌总数、活菌数等。此种检测方法已经应用在了检测水中污染的细菌数量。然而其高昂的费用和复杂的设备也限制了其进一步发展。而作为鉴定细菌最早发展起来的培养法，已改进为在培养基中加入特异性生化发硬底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，使得培养物的选择、分离和鉴定能够一次性完成。虽然此方法已广泛应用于临床，但仍然存在许多不足之处，如检测所需时间较长、指示剂系统单一等。酶联免疫法是一种固相酶免疫分析的方法，既可检测抗原，又可检测抗体，既能定性，也能够定量。但该方法也存在检测时间长、抗体制备困难、存在假阳性等缺点和不足。实时定量pcr通过直接测定pcr过程中荧光信号的变化，利用电脑分析软件对pcr过程中产生的扩增产物进行动态监测和自动定量，但是pcr需要变温热循环过程，需要专业人员配备专业仪器进行操作，检测时间长，限制其在现场检测的应用。
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技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在提出一种金黄色葡萄球菌的重组聚合酶扩增引物及检测方法，以重组酶聚合酶扩增反应(rpa)为基础，结合侧流层析试纸，能够快速、灵敏、高特异度地进行金黄色葡萄球菌检测，实现肉眼可见检测。
2、为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供一种金黄色葡萄球菌的重组聚合酶扩增引物，所述重组聚合酶扩增引物包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物及核苷酸序列如seq idno.2所示的下游引物。
4、进一步地，所述上游引物的5’端biotin修饰。
5、进一步地，seq id no.1：5’-(biotin)cga caa taa caa agt aat tgc agc aagcct tt，-3’；
6、进一步地，所述下游引物的5’端fitc修饰。
7、进一步地，seq id no.2：5’-(fitc)cga cct tca aat ggc acg ata tct tta tcata-3’。
8、第二方面，本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如上任一所述的重组聚合酶扩增引物。
9、进一步地，所述试剂盒中上游引物及下游引物的浓度均≥0.625μm；优选为0.625μm-5μm；进一步优选为0.625μm-1.5μm，例如可以为0.625μm、0.65μm、0.675μm、0.7μm、0.725μm、0.75μm、0.775μm、0.8μm、0.825μm、0.85μm、0.875μm、0.9μm、0.925μm、0.95μm、0.975μm、1μm、1.025μm、1.05μm、1.075μm、1.1μm、1.125μm、1.15μm、1.175μm、1.2μm、1.225μm、1.25μm、1.275μm、1.3μm、1.325μm、1.35μm、1.375μm、1.4μm、1.425μm、1.45μm、1.475μm、1.5μm。
10、进一步地，所述试剂盒包括检测重组聚合酶扩增产物的核酸检测试纸。
11、进一步地，所述核酸检测试纸包括与上游引物标记biotin结合的抗体和与下游引物标记fitc基团结合的抗体。
12、进一步地，所述试剂盒包括用于提取待测样本dna的试剂。
13、第三方面，本专利技术提供如上任一所述的重组聚合酶扩增引物或如上任一所述的试剂盒在制备以下任一产品中的应用：
14、(1)鉴定或辅助鉴定金黄色葡萄球菌的产品；
15、(2)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为金黄色葡萄球菌的产品；
16、(3)鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染或含有金黄色葡萄球菌的产品。
17、第四方面，本专利技术提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法，应用了如上任一所述的重组聚合酶扩增引物或如上任一所述的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：
18、(1)提取待测样本的dna；
19、(2)以待测样本的dna为模板，使用核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物及核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物进行重组聚合酶扩增反应，得到扩增产物；
20、(3)对扩增产物进行检测。
21、进一步地，所述步骤(3)包括以下步骤：
22、使用检测重组聚合酶扩增产物的核酸检测试纸对扩增产物进行检测；
23、若所述核酸检测试纸显色阳性，则所述待测样本中含有或候选含有金黄色葡萄球菌核酸或感染或候选感染金黄色葡萄球菌；
24、若所述核酸检测试纸显色阴性，则所述待测样本中不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌核酸或不感染或候选不感染本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种金黄色葡萄球菌的重组聚合酶扩增引物，其特征在于：所述重组聚合酶扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的重组聚合酶扩增引物，其特征在于：所述上游引物的5’端Biotin修饰。
3.根据权利要求1所述的重组聚合酶扩增引物，其特征在于：所述下游引物的5’端FITC修饰。
4.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1-3任一所述的重组聚合酶扩增引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测重组聚合酶扩增产物的核酸检测试纸。
6.如权利要求1-3任一所述的重组聚合酶扩增引物或如权利要求4-5任一所述的试剂盒在制备以下任一产品中的应用：
7.一种金黄色葡萄球菌的检测方法，应用了如权利要求1-3任一所述的重组聚合酶扩增引物或如权利要求4-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)包括以下步骤：p>
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述重组聚合酶扩增反应的反应体系以50μL计，包括：上游引物2.4μL；下游引物2.4μL；无引物重泡胀缓冲液29.5μL；模板及蒸馏水13.2μL；Mg2+溶液2.5μL。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述重组聚合酶扩增反应的反应温度为37℃-42℃，反应时间为10-45min。
...【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌的重组聚合酶扩增引物，其特征在于：所述重组聚合酶扩增引物包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物及核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的重组聚合酶扩增引物，其特征在于：所述上游引物的5’端biotin修饰。
3.根据权利要求1所述的重组聚合酶扩增引物，其特征在于：所述下游引物的5’端fitc修饰。
4.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1-3任一所述的重组聚合酶扩增引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测重组聚合酶扩增产物的核酸检测试纸。
6.如权利要求1-3任一所述的重组聚合酶扩增引物或如权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜晓辉，黄亮，焦亚楠，胡时栋，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第一医学中心，
类型：发明
国别省市：
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