【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，尤其涉及一种泛酸合成酶突变体及其应用。
技术介绍
1、泛醇又称原维生素b5，化学分子式c9h19no4，相对分子量205.25，泛醇的构象分为d型和l型，其中只有d型的泛醇有生物活性。d-泛醇在生物体内能被快速氧化成d-泛酸参与到乙酰辅酶a的代谢中去，因此，它时常被当作维生素b5的同效物，作为膳食补充剂应用到饲料领域，以提高饲料的营养价值。此外d-泛醇在其他众多领域也应用广泛，包括医药、化妆品、洗护发产品等。目前，d-泛醇市场规模也将不断增长。
2、泛醇在工业中是通过化学法合成，现阶段已知的d-泛醇的合成方法多为d-泛解酸内酯和3氨基丙醇通过化学缩合来进行合成.其中d-泛酰内酯的合成是通过将外消旋化的d-泛酰内酯使用酶法或化学法拆分得到。外消旋的泛酰内酯多是通过小分子物质通过多步的化学反应得到，包括异丁醛和甲醛之间的醛醇反应，氰化氢与生成的羟基醛的加成反应，以及形成的氰醇与相应的羧酸的酸水解反应以及d-泛解酸的内酯化反应。这种方法是工业上目前所大规模应用的方法，但其现阶段也存在许多问题，如由于底物的泛酰内酯需要具有严格的d型构象，所以生产过程中l-泛解酸内酯需要重新消旋化反应，这无疑提高了d-泛醇的相应成本。而且此过程中需要用到大量的有机试剂和有毒的氰化物，不符合环境友好性的需求。相比之下，微生物发酵法生产具有成本低、环境友好，可持续的优点。
3、现有的以微生物直接发酵法生产d-泛酸生产菌主要包括大肠杆菌(escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium
技术实现思路
1、为了解决上述泛酸合成酶催化效率低的技术问题，本专利技术提供了一种泛酸合成酶突变体及其应用。本专利技术通过对来源于大肠杆菌的泛酸合成酶的第62位、第123位、第189位氨基酸进行定点突变，通过活性口袋附近丙氨酸扫描策略，定点定向突变改变蛋白质氨基酸残基，将第62位笨丙氨酸突变为异亮氨酸和/或第123位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺和/或第189位精氨酸变为异亮氨酸，提高泛酸合成酶催化d-泛醇的效率，提高d-泛醇的产量。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供了一种泛酸合成酶突变体，由如seq id no.1所示的氨基酸序列进行以下位点的单点突变或者多点组合突变得到：
4、第62位笨丙氨酸突变为异亮氨酸；
5、第123位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺；
6、第189位精氨酸变为异亮氨酸。
7、本专利技术通过对来源于大肠杆菌的泛酸合成酶(氨基酸序列如seq id no.1所示)的第62位、第123位、第189位氨基酸进行定点突变，通过活性口袋附近丙氨酸扫描策略，定点定向突变改变蛋白质氨基酸残基，将第62位笨丙氨酸突变为异亮氨酸和/或第123位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺和/或第189位精氨酸变为异亮氨酸，提高泛酸合成酶催化d-泛醇的效率，提高d-泛醇的产量。
8、作为优选，泛酸合成酶突变体为由如seq id no.1所示的氨基酸序列进行以下位点的多点组合突变得到：第62位笨丙氨酸突变为异亮氨酸、第123位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺、第189位精氨酸变为异亮氨酸。
9、当泛酸合成酶的第62位、第123位、第189位氨基酸同时进行突变时，泛酸合成酶的重组大肠杆菌可将泛酸合成酶催化d-泛醇合成的效率提升1.32倍，携带了所构建的泛酸合成酶突变体的基因工程菌株在摇瓶发酵泛醇中产量提升3.65倍，d-泛醇合成的效率提升达到最大化。
10、第二方面，本专利技术提供了上述泛酸合成酶突变体的编码基因。
11、第三方面，本专利技术提供了一种重组载体，其包含上述编码基因。
12、作为优选，所述载体为ptrc99a或pet-28a(+)。
13、第四方面，本专利技术提供了一种基因工程菌，其包含上述编码基因或上述重组载体。
14、作为优选，所述基因工程菌为大肠杆菌。
15、第四方面，本专利技术提供了上述泛酸合成酶突变体在制备d-泛醇中的应用。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：
17、1、本专利技术通过对来源于大肠杆菌的泛酸合成酶(氨基酸序列如seq id no.1所示)的第62位、第123位、第189位氨基酸进行定点突变，通过活性口袋附近丙氨酸扫描策略，定点定向突变改变蛋白质氨基酸残基，将第62位笨丙氨酸突变为异亮氨酸和/或第123位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺和/或第189位精氨酸变为异亮氨酸，提高泛酸合成酶催化d-泛醇的效率，提高d-泛醇的产量。
18、2、当泛酸合成酶的第62位、第123位、第189位氨基酸同时进行突变时，泛酸合成酶的重组大肠杆菌可将泛酸合成酶催化d-泛醇合成的效率提升1.32倍，携带了所构建的泛酸合成酶突变体的基因工程菌株在摇瓶发酵泛醇中产量提升3.65倍，d-泛醇合成的效率大大提升。
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1.一种泛酸合成酶突变体，其特征在于：由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行以下位点的单点突变或者多点组合突变得到：
2.如权利要求1所述的一种泛酸合成酶突变体，其特征在于：由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行以下位点的多点组合突变得到：第62位笨丙氨酸突变为异亮氨酸、第123位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺、第189位精氨酸变为异亮氨酸。
3.如权利要求1～2任一项所述泛酸合成酶突变体的编码基因。
4.一种重组载体，其特征在于：包含权利要求3所述的编码基因。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述载体为pTrc99a或pET-28a(+)。
6.一种基因工程菌，其特征在于：包含权利要求3所述的编码基因或权利要求4所述的重组载体。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为大肠杆菌。
8.如权利要求1～2任一项所述泛酸合成酶突变体在制备D-泛醇中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种泛酸合成酶突变体，其特征在于：由如seq id no.1所示的氨基酸序列进行以下位点的单点突变或者多点组合突变得到：
2.如权利要求1所述的一种泛酸合成酶突变体，其特征在于：由如seq id no.1所示的氨基酸序列进行以下位点的多点组合突变得到：第62位笨丙氨酸突变为异亮氨酸、第123位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺、第189位精氨酸变为异亮氨酸。
3.如权利要求1～2任一项所述泛酸合成酶突变体的编码基因。
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，周俊平，张政，辛歆媛，黄良刚，逄爱萍，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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