【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学检测领域，特别是涉及一种快速检测猪δ冠状病毒iga抗体的间接elisa试剂盒。
技术介绍
1、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)是新发现的一种新型猪肠道冠状病毒，可感染所有日龄的猪，主要引起10日龄以内的仔猪发生急性腹泻、呕吐和死亡。2021年12月《nature》期刊报道，从海地的三名发热儿童血清样本中检测并分离到了猪δ型冠状病毒，表明该病毒具有感染人的风险，快速准确地疾病诊断对于该病的防控至关重要。
2、pdcov作为一种肠道病原体，其在粘膜表面的复制特性使得对iga抗体的关注显得尤为重要。新生仔猪的免疫系统尚未完全成熟，仔猪主要通过摄入初乳来获得母源性抗pdcov特异性iga。初乳中的iga通过消化道被仔猪吸收后，可为仔猪提供被动免疫保护。通过检测母乳或血清中pdcov特异性iga的浓度，可以评估母猪的免疫状态以及仔猪获得的被动免疫水平，对于制定有效的疫苗接种策略和疾病防控措施具有重要意义。本专利技术拟开发一种检测猪δ冠状病毒iga抗体的间接elisa检测试剂盒，以期为pdcov特异性iga的检测提供技术支持。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种快速检测猪δ冠状病毒iga抗体的间接elisa试剂盒以解决上述现有技术存在的问题。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种快速检测猪δ冠状病毒iga抗体的间接elisa试剂盒，包括包被抗原的
4、所述抗原为重组pdcov s2蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
5、进一步地，所述包被抗原的酶标板的制备方法包括以下步骤：
6、将所述重组pdcov-s2蛋白的混悬液加入酶标孔中，于37℃恒温箱中孵育30min，去除上清，用pbst洗涤3次后弃去上清，加入封闭液，于37℃的摇床中封闭2h，得到所述包被抗原的酶标板。
7、进一步地，所述重组pdcov-s2蛋白在所述混悬液中的浓度为0.125-2.0μg/ml。
8、优选地，所述重组pdcov-s2蛋白在所述混悬液中的浓度为1μg/ml。
9、进一步地，所述封闭液为1-5g/l的脱脂奶粉pbs溶液。
10、优选地，所述封闭液为5g/l的脱脂奶粉pbs溶液。
11、进一步地，所述间接elisa试剂盒还包括酶标二抗、稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阴性标准品和阳性标准品。
12、进一步地，所述酶标二抗为hrp标记的山羊抗猪iga。
13、进一步地，所述稀释液为含10％牛血清蛋白和0.1％液体生物防腐剂proclin-300的0.01m ph 7.4的pbs缓冲液；所述洗涤液为含有0.5％tween 20的0.01m ph 7.4的pbst缓冲液。
14、进一步地，所述显色液为tmb溶液。
15、进一步地，所述终止液为2mol/lh2so4溶液。
16、本专利技术还提供一种非疾病诊断目的检测猪δ冠状病毒iga抗体的方法，包括采用上述的间接elisa试剂盒检测猪δ冠状病毒iga抗体的步骤：
17、向包被抗原的酶标板中分别加入100μl稀释液、阴性标准品、阳性标准品、待测样本液，在37℃下孵育30min，孵育完成后用洗涤液冲洗3遍；
18、各反应孔加入稀释后的酶标二抗，在37℃下孵育30min，孵育完成后用洗涤液冲洗3遍；
19、各反应孔加入显色液，37℃闭光孵育10min；
20、各反应孔加入终止液，在450nm波长处用酶标仪测定吸光度值；
21、结果判定：当od450nm≥0.273时，判断为阳性，即待测样本液含有猪δ冠状病毒iga抗体；当od450nm<0.273时，判断为阴性，即待测样本液不含猪δ冠状病毒iga抗体。
22、本专利技术公开了以下技术效果：
23、本专利技术根据流行毒株pdcov hnzk-04株(genbank登录号：mh708124)的s2基因序列设计引物，扩增pdcov s2基因，并将其构建重组表达质粒pet-32a(+)，转化大肠杆菌bl21后，通过优化表达条件，获得了重组pdcov s2蛋白，采用ni-nta亲和层析对其进行纯化。以重组pdcov s2蛋白为包被抗原制作的酶标板捕获pdcov特异性的iga抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪iga为检测抗体，可以在酶标板上形成“pdcov-s2蛋白-pdcov-s2特异性iga抗体-酶标记抗体”三聚体复合物，通过底物颜色变化和吸光度值的测定即可直接判定结果。
24、本专利技术基于间接elisa检测技术构建的试剂盒，能够在保证高灵敏度和强特异性的条件下将整体反应时间严格控制在1.5-2h内，极大地缩短了操作时间，提高了检测效率。本专利技术通过优化试剂盒中不同试剂的参数条件，最终得到最优的检测条件：最佳包被抗原的浓度为1μg/ml，最佳封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间为2h，最佳酶标抗体(1mg/ml)的稀释度为1:60000，最佳显色时间为10min。在此最优条件下检测猪δ冠状病毒iga抗体结果显示，当od450nm≥0.273时，判断为阳性，即待测样本含有猪δ冠状病毒iga抗体；当od450nm＜0.273时，判断为阴性，即待测样本不含猪δ冠状病毒iga抗体。本专利技术方便易操作、高效且成本低，检测特异性达100％。
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1.一种快速检测猪δ冠状病毒IgA抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被抗原的酶标板；
2.根据权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的酶标板的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述重组PDCoV-S2蛋白在所述混悬液中的浓度为1μg/mL。
4.根据权利要求2所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5g/L的脱脂奶粉PBS溶液。
5.根据权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA试剂盒还包括酶标二抗、稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阴性标准品和阳性标准品。
6.根据权利要求5所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗猪IgA抗体。
7.根据权利要求5所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含10％牛血清蛋白和0.1％液体生物防腐剂Proclin-300的0.01M pH 7.4的PBS缓冲液；所述洗涤液为含有0.5％Tween 20的0.01M p
8.根据权利要求5所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB溶液。
9.根据权利要求5所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/LH2SO4溶液。
10.一种非疾病诊断目的检测猪δ冠状病毒IgA抗体的方法，其特征在于，包括采用权利要求1-9任一项所述的间接ELISA试剂盒检测猪δ冠状病毒IgA抗体的步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种快速检测猪δ冠状病毒iga抗体的间接elisa试剂盒，其特征在于，包括包被抗原的酶标板；
2.根据权利要求1所述的间接elisa试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的酶标板的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的间接elisa试剂盒，其特征在于，所述重组pdcov-s2蛋白在所述混悬液中的浓度为1μg/ml。
4.根据权利要求2所述的间接elisa试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5g/l的脱脂奶粉pbs溶液。
5.根据权利要求1所述的间接elisa试剂盒，其特征在于，所述间接elisa试剂盒还包括酶标二抗、稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阴性标准品和阳性标准品。
6.根据权利要求5所述的间接elisa试剂盒，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡慧，魏战勇，项玉强，郭东辉，闫花朵，宋润泽，刘可心，刘缓缓，岳晓漫，胡亚婷，郑兰兰，张红垒，陈丽颖，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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