【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种大肠杆菌培养基及其在制备无细胞蛋白合成所需细胞提取物中的应用。
技术介绍
1、无细胞蛋白合成技术是一种没有活细胞参与，在体外进行转录、翻译生产蛋白质的新技术，越来越受到研究人员的关注和应用。无细胞蛋白合成利用细胞提取物中的活性成分，如核糖体、翻译因子、氨酰trna合成酶、能量代谢相关的酶等，并添加ntp、氨基酸、能量物质、缓冲盐、金属离子等物质，在dna模板或rna模板存在的情况下，合成出目的蛋白质。其与传统的重组表达技术相比，具有快速、灵活、高通量、开放等优势，能够表达毒性蛋白、膜蛋白、非天然氨基酸嵌入蛋白等传统手段表达困难的蛋白质。
2、无论科研报导抑或商业化试剂盒，大肠杆菌无细胞是涉及最多的，原因在于大肠杆菌生长速度快、重组表达量高、基因改造完善、研究最为充分。世界范围内已有多家公司开发出了商业化的无细胞蛋白表达试剂盒，如苏州珀罗汀、neb、promega等公司。但目前大肠杆菌无细胞蛋白合成体系尚有局限性，最大的问题在于反应体积仍然偏小，成本偏高。造成这一局限性最重要的原因是细胞提取物的制备效率不高。通常用于胞内重组表达的大肠杆菌高密度发酵，菌体密度(以吸光度od600计算)能够达到50以上，发酵液固含量能够达到10％以上。但用于制备无细胞蛋白合成所需细胞提取物的大肠杆菌发酵，必须选择在对数生长期收菌，才能保证细胞提取物有最佳的活性，导致一般发酵结束的od600值只能在1.5-3左右，和通常的高密度发酵相差20倍以上。于是导致绝大多数的细胞提取物制备是通过摇瓶发酵获得的，少数使用
3、根据文献(zawada et al.biotechnol bioeng 94:618-624)报道，细胞提取物的活性和大肠杆菌的比生长速率μ严格相关。大肠杆菌对数生长期μ大于1.0h-1，此时菌体的代谢最为旺盛，菌体内部含有的核糖体、trna等翻译相关因子达到最大的丰度，有利于无细胞蛋白表达反应。而通常的高密度发酵，比生长速率μ降低到0.3h-1，细胞提取物的活性也大打折扣。此外，当菌体处于非对数生长期时，其内部的转录、翻译抑制因子的含量相应提高了，不利于无细胞蛋白表达。因此，通过设计新的培养基配方以及调整优化补料策略，在发酵过程中保持菌体在对数生长期生长并维持较大的比生长速率μ，是提高收菌od600的关键。
4、大肠杆菌常用的培养基配方有lb，2ytp，2ytpg等，其含有酵母提取物、大豆蛋白冻、磷酸缓冲盐和葡萄糖等。其中葡萄糖是大肠杆菌能常应用的碳源，能被大肠杆菌迅速利用，有利于其快速生长。葡萄糖做为碳源时会产生葡萄糖效应，造成代谢中间产物乙酸的积累。有文献(lee sy.trends biotechnol 14:98-105)报道，以葡萄糖做为碳源，当比生长速率大于0.3h-1时，就会积累乙酸，从而影响比生长速率和最终的菌体od600。在批式-补料培养过程中，往往需要对葡萄糖补料速率进行细致复杂的调控，将残糖保持在非常低的水平，从而避免产生酸的积累。因此从这一角度看，葡萄糖不是制备细胞提取物的理想碳源，研究其他碳源对细胞提取物制备的影响是非常有必要的。
技术实现思路
1、专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种大肠杆菌培养基，解决了无细胞蛋白合成所需大肠杆菌细胞提取物制备时菌体密度低下的问题，有效提高无细胞蛋白表达产率。
2、本专利技术还提供了一种大肠杆菌培养基在制备细胞提取物中的应用，在100l发酵规模上将细胞提取物制备的收菌od600由1-3提高到了60以上，大幅度提高了细胞提取物的制备效率，降低了成本。
3、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术提供一种大肠杆菌培养基，所述培养基包括初始培养基或者初始培养基和补料培养基，所述初始培养基包括果糖、乳糖、硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、微量元素及维生素溶液、氮源，所述补料培养基包括碳源和氮源，所述碳源为果糖和硫酸镁溶液，所述初始培养基和补料培养基中的氮源均为包括添加了酵母粉和酵母蛋白胨的氮源溶液。
4、进一步地，所述初始培养基包括质量分数果糖1-3％、乳糖0.1-1％、硫酸镁0.1-0.5％、硫酸铵0.1-0.4％、磷酸氢二钾0.5-5％、磷酸二氢钾0.2-3％、柠檬酸0.1-2％、微量元素及维生素溶液0.01％-0.5％、氮源溶液0.5-2％。
5、作为优选，所述初始培养基的用量为：果糖1-3％、乳糖0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸铵0.25％、磷酸氢二钾2％、磷酸二氢钾0.75％、柠檬酸0.22％、微量元素及维生素溶液0.1％、氮源溶液1％。
6、进一步地，所述微量元素及维生素溶液包括五水合硫酸铜、氯化锌、七水合硫酸亚铁、无水氯化钴、二水合氯化钙、一水合硫酸锰、生物素、维生素b12、二水合叶酸。
7、进一步地，所述微量元素及维生素溶液浓度分别为：五水合硫酸铜0.1-2g/l、氯化锌0.1-0.7g/l、七水合硫酸亚铁1-5g/l、无水氯化钴0.2-4g/l、二水合氯化钙0.5-6g/l、一水合硫酸锰0.5-5g/l、生物素0.05-0.2g/l、维生素b120.005-0.02g/l、二水合叶酸0.01-0.2g/l。
8、作为优选，所述微量元素及维生素溶液配方浓度分别为：五水合硫酸铜0.28g/l、氯化锌0.14g/l、七水合硫酸亚铁2.8g/l、无水氯化钴1.3g/l、二水合氯化钙1.5g/l、一水合硫酸锰1.9g/l、生物素0.1g/l、维生素b120.01 g/l、二水合叶酸0.07g/l。
9、进一步地，所述碳源中果糖浓度为300-600g/l、硫酸镁浓度为10-20g/l。
10、进一步地，所述氮源溶液中酵母粉浓度为20-100g/l、酵母蛋白胨浓度为50-150g/l。
11、本专利技术所述大肠杆菌培养基在制备细胞提取物中的应用。
12、本专利技术所述大肠杆菌培养基在制备无细胞蛋白合成所需细胞提取物中的应用。
13、进一步地，所述应用过程包括如下步骤：
14、(1)在含有大肠杆菌升温发酵罐中进行批式-补料发酵培养，当初始培养基中的碳源耗尽，溶氧出现极速上升时，开始补加碳源和氮源，测定od600，停止发酵，离心，重悬洗涤后收集菌体；
15、(2)将步骤(1)制备的菌体加入s30缓冲溶液中，破碎后离心，收集上清液，即为细胞提取物。
16、进一步地，步骤(1)所述碳源和氮源补加量分别为10-15ml，碳源添加速率为0.2-0.45ml/l/min，氮源添加速率为碳源的20-40％。
17、作为优选，步骤(1)中碳源初始补料速率为0.33ml/l/min，然后以指数速率k＝1.0h-1提高，所述氮源的补料本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大肠杆菌培养基，其特征在于，所述培养基包括初始培养基或者初始培养基和补料培养基，所述初始培养基包括果糖、乳糖、硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、微量元素及维生素溶液、氮源，所述补料培养基包括碳源和氮源，所述碳源为果糖和硫酸镁溶液，所述初始培养基和补料培养基中的氮源均为包括添加了酵母粉和酵母蛋白胨的氮源溶液。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述初始培养基包括质量分数果糖1-3％、乳糖0.1-1％、硫酸镁0.1-0.5％、硫酸铵0.1-0.4％、磷酸氢二钾0.5-5％、磷酸二氢钾0.2-3％、柠檬酸0.1-2％、微量元素及维生素溶液0.01％-0.5％、氮源溶液0.5-2％。
3.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述微量元素及维生素溶液包括五水合硫酸铜、氯化锌、七水合硫酸亚铁、无水氯化钴、二水合氯化钙、一水合硫酸锰、生物素、维生素B12、二水合叶酸。
4.根据权利要求3所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述微量元素及维生素溶液浓度分别为：五水合硫酸铜0.1-2g/L、氯化锌0.1-0.7g/L、
5.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述碳源中果糖浓度为300-600g/L、硫酸镁浓度为10-20g/L。
6.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述氮源溶液中酵母粉浓度为20-100g/L、酵母蛋白胨浓度为50-150g/L。
7.一种权利要求1所述大肠杆菌培养基在制备细胞提取物中的应用。
8.一种权利要求1所述大肠杆菌培养基在制备无细胞蛋白合成所需细胞提取物中的应用。
9.根据权利要求7或者8所述应用，其特征在于，所述应用过程包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，步骤(1)所述碳源和氮源补加量分别为10-15ml，碳源添加速率为0.2-0.45ml/L/min，氮源添加速率为碳源的20-40％。
...【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌培养基，其特征在于，所述培养基包括初始培养基或者初始培养基和补料培养基，所述初始培养基包括果糖、乳糖、硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、微量元素及维生素溶液、氮源，所述补料培养基包括碳源和氮源，所述碳源为果糖和硫酸镁溶液，所述初始培养基和补料培养基中的氮源均为包括添加了酵母粉和酵母蛋白胨的氮源溶液。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述初始培养基包括质量分数果糖1-3％、乳糖0.1-1％、硫酸镁0.1-0.5％、硫酸铵0.1-0.4％、磷酸氢二钾0.5-5％、磷酸二氢钾0.2-3％、柠檬酸0.1-2％、微量元素及维生素溶液0.01％-0.5％、氮源溶液0.5-2％。
3.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述微量元素及维生素溶液包括五水合硫酸铜、氯化锌、七水合硫酸亚铁、无水氯化钴、二水合氯化钙、一水合硫酸锰、生物素、维生素b12、二水合叶酸。
4.根据权利要求3所述大肠杆菌培养基，其特征在于，所述微量元素及维生素溶液浓度分别为：五水合硫酸铜0.1-2g/l、氯化锌...
【专利技术属性】
技术研发人员：任宏杰，朱小龙，金宁，陈科奇，邓锐，刘杨，高尊防，张胜胜，
申请(专利权)人：江苏百时美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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