【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物，尤其涉及一种用于制备环状rna的前体序列、rna环化方法、环状rna及应用。
技术介绍
1、i型内含子是一种具有自剪接催化活性的核酶，i型内含子所催化的自剪接反应是利用两步连续的磷酸酯键转移反应将自身从转录产物上剪切下来，同时完成两侧外显子的拼接。其中，pie策略是一种利用i型内含子的自剪切催化活性在体外合成环状rna的方法，将i型内含子基于催化反应的结构域拆分成仍具有催化活性的3'-内含子和5'-内含子，并将所得的3'-内含子和5'-内含子与待环化序列(包括编码蛋白或rna合成的编码序列和任选的kozak序列、ires序列等具有特殊功能的非编码序列)组装，且出于提高环化效率的考虑会额外引入与i型内含子两端邻接的外显子片段，最终获得具有3'-内含子-e2-待环化序列-e1-5'-内含子结构的前体序列，前体序列在经体外转录反应和体外环化反应，3'-内含子和5'-内含子被剪除，且位于待环化序列两端的外显子片段拼接，实现待环化序列的环化。
2、但是，采用现有pie策略所获得的环状rna残留有外源性核苷酸序列，所残留的外源核苷酸序列可能改变环状rna的折叠构象，或者与其它环状rna或残留前体序列发生配对，形成结构更加复杂的复合体。这将可能导致非预期的细胞免疫反应，且可能会影响rna的稳定性和翻译效率，导致目标蛋白表达降低，限制了pie策略及所获得的环状rna的进一步应用。
3、因此，获得一种环化后不残留或仅残留极少量外源性核苷酸且具有优秀环化效率的的前体序列，具有重要意义。
>技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种用于制备环状rna的前体序列。本专利技术提供的前体序列具有优秀的成环效率，且环化所得的环状rna中不残留或仅残留极少量的外源性核苷酸，具有良好的应用前景。
2、本专利技术的第二目的在于提供一种rna环化方法。
3、本专利技术的第三目的在于提供一种环状rna。
4、本专利技术的第四目的在于提供以上所述的用于制备环状rna的前体序列、rna环化方法和/或环状rna在制备药物、疫苗和/或高表达目标基因的细胞中的应用。
5、具体的，本专利技术提供的用于制备环状rna的前体序列沿着5'至3'的方向依次包括：3'-内含子、待环化序列和5'-内含子；所述待环化序列沿着5'至3'的方向依次包括ires序列和编码序列；且所述3'-内含子的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述5'-内含子的核苷酸序列如seq id no:4所示。
6、进一步地，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：促环化序列、3'-内含子、待环化序列和5'-内含子，且所述促环化序列与待环化序列靠近3'端的部分序列正向互补配对。
7、进一步地，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：3'-内含子、待环化序列、5'-内含子和促环化序列，且所述促环化序列与待环化序列靠近5'端的部分序列正向互补配对。
8、进一步地，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：促环化序列i、3'-内含子、待环化序列、5'-内含子和促环化序列ii，且所述促环化序列i与待环化序列靠近3'端的部分序列正向互补配对，所述促环化序列ii与待环化序列靠近5'端的部分序列正向互补配对。
9、进一步地，所述ires序列选自cvb3 ires序列、ev71 ires序列和emcv ires序列中的一种或多种。
10、本专利技术提供的rna环化方法包括：取上述前体序列进行体外转录反应，得到体外转录产物；取所述体外转录产物进行体外环化反应，得到环状rna。
11、进一步地，所述体外环化反应包括：所述体外环化反应包括：取所述体外转录产物于25～60℃下孵育15～60min，得到所述环状rna。
12、进一步地，所述体外环化反应包括：取所述体外转录产物于60～70℃下进行热变性预处理5～20min，接着于25～60℃下孵育15～60min，得到所述环状rna。
13、本专利技术提供的环状rna是通过上述rna环化方法制备得到的。
14、本专利技术还提供了上述用于制备环状rna的前体序列、rna环化方法和/或环状rna在制备药物、疫苗和/或高表达目标基因的细胞中的应用。
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1.一种用于制备环状RNA的前体序列，所述前体序列沿着5'至3'的方向依次包括：3'-内含子、待环化序列和5'-内含子，其特征在于，所述待环化序列沿着5'至3'的方向依次包括IRES序列和编码序列；且所述3'-内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述5'-内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的用于制备环状RNA的前体序列，其特征在于，所述前体序列还包括促环化序列，所述促环化序列连接于3'-内含子的5'端和/或5'-内含子的3'端；所述促环化序列与待环化序列正向互补配对驱使3'-内含子和5'-内含子相互靠近。
3.根据权利要求2所述的用于制备环状RNA的前体序列，其特征在于，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：促环化序列、3'-内含子、待环化序列和5'-内含子，且所述促环化序列与待环化序列靠近3'端的部分序列正向互补配对。
4.根据权利要求2所述的用于制备环状RNA的前体序列，其特征在于，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：3'-内含子、待环化序列、5'-内含子和促环化序列，且所述促环化序列
5.根据权利要求2所述的用于制备环状RNA的前体序列，其特征在于，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：促环化序列I、3'-内含子、待环化序列、5'-内含子和促环化序列II，且所述促环化序列I与待环化序列靠近3'端的部分序列正向互补配对，所述促环化序列II与待环化序列靠近5'端的部分序列正向互补配对。
6.根据权利要求1所述的用于制备环状RNA的前体序列，其特征在于，所述IRES序列选自CVB3 IRES序列、EV71 IRES序列和EMCV IRES序列中的一种或多种。
7.一种RNA环化方法，其特征在于，所述RNA环化方法包括：取权利要求1～6任意一项所述的前体序列进行体外转录反应，得到体外转录产物；取所述体外转录产物进行体外环化反应，得到环状RNA。
8.根据权利要求7所述的RNA环化方法，其特征在于，所述体外环化反应包括：取所述体外转录产物于25～60℃下孵育15～60min，得到所述环状RNA；
9.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA通过权利要求7或8所述的RNA环化方法制备得到。
10.权利要求1～6任意一项所述的用于制备环状RNA的前体序列、权利要求7或8所述的RNA环化方法和/或权利要求9所述的环状RNA在制备药物、疫苗和/或高表达目标基因的细胞中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于制备环状rna的前体序列，所述前体序列沿着5'至3'的方向依次包括：3'-内含子、待环化序列和5'-内含子，其特征在于，所述待环化序列沿着5'至3'的方向依次包括ires序列和编码序列；且所述3'-内含子的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述5'-内含子的核苷酸序列如seq id no:4所示。
2.根据权利要求1所述的用于制备环状rna的前体序列，其特征在于，所述前体序列还包括促环化序列，所述促环化序列连接于3'-内含子的5'端和/或5'-内含子的3'端；所述促环化序列与待环化序列正向互补配对驱使3'-内含子和5'-内含子相互靠近。
3.根据权利要求2所述的用于制备环状rna的前体序列，其特征在于，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：促环化序列、3'-内含子、待环化序列和5'-内含子，且所述促环化序列与待环化序列靠近3'端的部分序列正向互补配对。
4.根据权利要求2所述的用于制备环状rna的前体序列，其特征在于，所述前体序列沿着5'至3'方向依次包括：3'-内含子、待环化序列、5'-内含子和促环化序列，且所述促环化序列与待环化序列靠近5'端的部分序列正向互补配对。
5.根据权利要求2所述的用于制备环状rna的前体序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪大明，薛永博，杨宇，赵岩，李惠，
申请(专利权)人：毕昇北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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