【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，尤其涉及一种以海绵为载体的固定化脂肪酶及其制备和应用。
技术介绍
1、脂肪酶（lipase，ec 3.1.1.3）又称三酰基甘油水解酶，是一种广泛存在于自然界且在催化化学反应过程中起着重要作用的生物催化剂，可以在有水或无水环境下催化不同底物的一系列反应，如酯水解、酯合成、酯交换、醇解、酸解、氨解、酰胺化和外消旋体的分解。其中以在油水两相催化酯水解和在有机相中催化酯合成反应为主，使脂肪酶在食品生产加工、药物制造和医疗、环保、美妆、生物传感器、能源开发等行业具有广阔的应用前景。但由于游离脂肪酶只能在特定温和条件下保持活性，其催化效率易受外界环境影响而无法稳定，且难以回收进行重复使用，从而造成使用难度提升和成本提高。为了解决以上问题，拓展脂肪酶的作用范围，已探索了多种途径，如化学修饰、蛋白质工程、固定化等。其中脂肪酶的固定化已被证实是一种简便、可靠、有效的方法。对固定化材料的选择直接影响固定化体系的核心性能参数，应选用具有丰富的孔隙率，足够的表面积，稳定的理化性质，良好的生物亲和力，自由伸缩的骨架结构，便于操作，成本低廉等性质。
2、进一步地，针对脂肪酶不同的反应类型，海绵-脂肪酶固定化策略应与之相对做出调整。对于脂肪酶的水解反应来说，大多数脂肪酶都有一个可移动的多肽链，称为“lid”。在疏水界面，盖子移动，催化位置暴露并结合到底物上，酶活性增加，这称为界面活化。固定化载体内越多的油水界面意味着更高的催化效率。这就要求固定化材料有着足够大的比表面积，便于操作，以便后续人为构造油水界面。而在酯化反应中，
3、为达到特定效果，固定化材料的制备会通过数步化学反应和数种化学试剂合成，操作繁琐，反应复杂，成本高；在极端环境下无法保持自身结构的稳定性；无法保证良好的空间构型(空间、大小、粒度、孔隙率等)导致低酶载量；其中传质阻力影响水油通量是导致固定化酶较低催化效率的主要原因；载体材料上没有足够与脂肪酶结合的特异性位点，会导致固定化酶易受环境影响且在反应完成后发生脱落无法再次使用。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提出了一种以海绵为载体的固定化脂肪酶及其制备和应用，构建了具有高额酶载量、良好催化效率、环境稳定性好、重复使用次数高的固定化脂肪酶。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种以海绵为载体的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
3、（1）海绵于硅烷偶联剂中浸泡处理，第一烘干，得改性海绵；
4、（2）步骤（1）所得改性海绵与戊二醛和脂肪酶溶液混合，静置，洗脱处理，第二烘干，得固定化脂肪酶。
5、优选的，步骤（1）中所述海绵为三聚氰胺海绵；步骤（1）中所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液；步骤（1）中所述浸泡处理的时间为20~28h；步骤（1）中所述第一烘干的温度为70~90℃，所述第一烘干的时间为4~8h。
6、进一步优选的，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液的浓度为0.5~1.5wt%。
7、优选的，步骤（2）中所述改性海绵与戊二醛和脂肪酶溶液的混合比为0.5~1cm3：10~30μl：1~3ml。
8、进一步优选的，所述脂肪酶溶液的浓度为8~12mg/ml，所述脂肪酶溶液为洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶溶液。
9、优选的，步骤（2）中所述静置的时间为20~40min；步骤（2）中所述洗脱处理具体为将海绵浸入pbs溶液中反复挤压3~5次；步骤（2）中所述第二烘干的温度为50~70℃，所述第二烘干的时间为22~26h。
10、优选的，还包括以下步骤：步骤（2）所述固定化脂肪酶与pbs溶液混合，然后整体浸入含有油酸甘油酯的4-硝基苯棕榈酸酯的十二烷溶液中，超声反应，再加入无水乙醇终止反应，用pbs溶液提取固定化脂肪酶催化水解反应所得产物。
11、进一步优选的，所述含有油酸甘油酯的4-硝基苯棕榈酸酯的十二烷溶液中油酸甘油酯的浓度为0.5~1.5wt%，所述超声反应频率为15~40khz。
12、本专利技术还提供了所述制备方法制备所得固定化脂肪酶。
13、本专利技术还提供了所述制备方法制备所得固定化脂肪酶作为催化剂在催化水解反应和/或酯化反应中的应用。
14、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和技术效果：
15、本专利技术提出了一种以海绵为载体的固定化脂肪酶及其制备方法，简单、高效且成本低。通过一步浸渍法在三聚氰胺海绵（ms）框架上引入疏水基团，在改性ms孔隙中通过物理吸附和交联的方式固定脂肪酶，构建具有高额酶载量、良好催化效率、良好环境稳定性、高重复使用次数的固定化脂肪酶。ms有独特的3d网状结构，约为99%的孔隙率使其有着数倍于自身的吸附量。极大的比表面积，为脂肪酶提供大量附着位点。其化学结构是由2，4，6-三氨基三嗪骨架组成，由于碳氮杂环结构的物理化学稳定性，使得ms在大多数环境下都能维持其原有结构，相比于其他固定化载体，ms可以直接从市场上以极低的价格购买获得，无需通过复杂的化学反应合成，节约了成本。
16、具体为将ms浸入3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）改性液中并热处理干燥形成ams，再将ams浸入脂肪酶液中反复挤压，完全浸满后烘干形成ams-lipase；交联法通过戊二醛作为交联剂，形成ams-ga-lipase。在固定化过程中，脂肪酶的氨基与戊二醛的醛基团之间发生了席夫碱反应。戊二醛作为交联剂，两端的游离醛基既能与脂肪酶氨基端基团反应，又能与接枝在海绵表面aptes的氨基反应。
17、本专利技术制备所得固定化脂肪酶无论在低温或是高温环境下进行反应的酶活力几乎不变，均保持室温环境下最高值，体现出海绵-脂肪酶体系具有良好的温度稳定性。此外，相比于游离酶的分散性和灵活性，酶的活性位点直接暴露于环境中，与载体固定化后的酶分子限制在海绵骨架之间，对酶的活性位点起到保护作用。
18、ams-ga-lipase相比于普通物理吸附固定化酶，有效提高了重复使用过程中的使用次数，在重复使用3次后维持同一酶活力直到使用8次。
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1.一种以海绵为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述海绵为三聚氰胺海绵；步骤（1）中所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液；步骤（1）中所述浸泡处理的时间为20~28h；步骤（1）中所述第一烘干的温度为70~90℃，所述第一烘干的时间为4~8h。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液的浓度为0.5~1.5wt%。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述改性海绵与戊二醛和脂肪酶溶液的混合比为0.5~1cm3：10~30μL：1~3mL。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述脂肪酶溶液的浓度为8~12mg/mL，所述脂肪酶溶液为洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶溶液。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述静置的时间为20~40min；步骤（2）中所述洗脱处理具体为将海绵浸入PBS溶液中反复挤压3~5次；步骤（2）中所述第二烘干的温度为50~70℃
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：步骤（2）所述固定化脂肪酶与PBS溶液混合，然后整体浸入含有油酸甘油酯的4-硝基苯棕榈酸酯的十二烷溶液中，超声反应，再加入无水乙醇终止反应，用PBS溶液提取固定化脂肪酶催化水解反应所得产物。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述含有油酸甘油酯的4-硝基苯棕榈酸酯的十二烷溶液中油酸甘油酯的浓度为0.5~1.5wt%，所述超声反应频率为15~40kHz。
9.如权利要求1~8任一项所述制备方法制备所得固定化脂肪酶。
10.如权利要求1~8任一项所述制备方法制备所得固定化脂肪酶作为催化剂在催化水解反应和/或酯化反应中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种以海绵为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述海绵为三聚氰胺海绵；步骤（1）中所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液；步骤（1）中所述浸泡处理的时间为20~28h；步骤（1）中所述第一烘干的温度为70~90℃，所述第一烘干的时间为4~8h。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液的浓度为0.5~1.5wt%。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述改性海绵与戊二醛和脂肪酶溶液的混合比为0.5~1cm3：10~30μl：1~3ml。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述脂肪酶溶液的浓度为8~12mg/ml，所述脂肪酶溶液为洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶溶液。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：郦金龙，崔舰刚，王语淇，张倩倩，朱运平，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：
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