本发明专利技术公开一种特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体及其设计方法和应用，通过生物信息学分析了适配体和SEA的结合机制。同时在分子对接辅助下进行序列融合设计实验，可以清晰地获得与靶标结合相关的适配体核心序列，提高工作效率和节约成本，最终获得了亲和力约是初始适配体1.79倍的高亲和力适配体，并成功应用于SEA的检测。本发明专利技术不仅获得了针对SEA的最佳适配体，为其实际应用奠定了基础，也为适配体的优化提供了良好的参考。同时，本发明专利技术中使用的融合设计方法可能对不同目标的稳定、低成本和高亲和力适配体提供一种有效且通用的策略。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体的说是涉及一种特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素a的核酸适配体及其设计方法和应用。
技术介绍
1、金黄色葡萄球菌肠毒素(ses)是由金黄色葡萄球菌分泌的细菌外毒素，会引起包括食物中毒和中毒性休克综合症等重大食源性疾病，进而引起胃肠炎，且潜伏期短(约6-8小时)，症状包括腹痛、呕吐、恶心和腹泻等。此外，ses还通过激活t细胞增殖的能力在免疫系统反应中充当超级抗原。其中金黄色葡萄球菌肠毒素a(sea)之所以作为广泛研究的ses之一，主要是因为它引起的食物中毒事件比例占所报道的葡萄球菌中毒病例的80％。sea对大多数消除细菌细胞的处理都具有抗性，如热处理和低ph值都不会引起其失活变性，因此即使在加工后也可能在食物中存在。同时，sea对蛋白水解酶的抵抗性也使得它们可以不受影响地通过消化道，从而增加患病的风险。此外，对于成人(体重70kg)，摄入50ng的sea即可引起食物中毒，甚至引起危及生命的中毒性休克。因此，sea的检测对食品安全具有重要意义。
2、目前，sea的检测技术可分为动物学实验、分子生物学技术和免疫学分析法。然而，由于实验动物不易获得性，存在伦理问题，动物学实验已被逐渐淘汰。分子生物学方法可以解决这些问题，但由于需要高质量的样品、昂贵的设备和专业的技术人员，它们的应用也受到限制。随着新兴技术的发展，生物传感器在sea的超灵敏检测中发挥着越来越重要的作用。然而，生物传感器技术所用到的抗体制备成本高、耗费周期长。为了改善这一缺陷，适配体因其出色的灵敏度和成本效益而受到越来越多关注。
>3、筛选核酸适配体的主要方法是指数富集的配体系统进化技术(selex)。该技术从至少包含1015个核苷酸分子的初始随机序列文库中筛选出高亲和力适配体。在筛选过程中，需要合成和鉴定多个适配体序列，会耗费大量的时间和资源。为了解决这个问题，人们开发了利用计算机筛选的方式来优化和设计适配体，此法有助于设计具有靶向结合位点的高亲和力核酸适配体。4、基于以上问题，本专利技术在生物信息学辅助下分析适配体和金黄色葡萄球菌肠毒素a(sea)的结合机制，并通过分子对接辅助对序列进行融合设计能够获得高亲和力适配体。我们的数据证明了sea适配体的成功设计和应用，并提出了一种适用于其他目标分子的是适配体设计的方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素a的核酸适配体及其设计方法和应用。
2、为了实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供一种特异性识别sea的适配体，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、5’-cctaaccgatatcagatgtcttactacgttggtacttttatgat ctctattcgt-3’，seq idno.1，为人工序列。
5、本专利技术提供一种特异性识别sea的适配体的设计方法：
6、(1)构建初始适配体二级结构、三级结构及sea的3d结构；
7、(2)对初始适配体三级结构进行分子对接及构象分析：
8、以初始适配体三级结构为受体，步骤(1)中sea的3d结构为配体，对受体和配体进行分子对接，获得sea-初始适配体，并对对接分数高、均方根差(rmsd)低的sea-初始适配体进行构象分析，分子对接结果和ligplot+v2.2的分析图有助于确定参与sea相互作用的核苷酸；
9、(3)构建融合设计后的sea-适配体：
10、根据得到的重要结合位点对步骤(1)中的初始适配体的核苷酸序列进行融合。将这些重要结合核苷酸挑选出来，同时截掉不参与作用的核苷酸，然后，融合多个适配体的参与作用的核苷酸，最终产生了10个序列，对这些适配体和sea的3d结构进行分子对接，形成sea-适配体；
11、(4)亲和力测定：
12、从步骤(3)中选取具有较多的参与作用的核苷酸数目、较低的rmsd值以及较高的对接分数的前四个适配体进行微量热泳动实验，验证其亲和力，获得高亲和力适配体。
13、进一步地，所述步骤(1)中初始适配体的核苷酸序列如seq id no.2所示：
14、a29:5’-agcagcagaggtcagatgtattatcttactacgttgcatc ctacttttatagtcccctcctatgcgtgctaccgtgaa-3’，seq id no.2，，为人工序列；
15、c7：5’-cctaaccgatatcacactcacagtataccgctccaccagtg tgatatcgggatctgctgacgttggtcgtcattggagtatc-3’，seq id no.3，为人工序列；
16、进一步的，所述步骤(2)中的初始适配体作为模板，根据分子对接结果，运用ds(discovery studio)、ligplot+v2.2工具进行可视化，确定初始适配体与sea的对接位点。从而进行多条适配体的融合，设计出新的适配体序列；
17、进一步的，所述步骤(4)中亲和力测定需要在适配体的3’端修饰6-fam基团；
18、本专利技术提供了一种如上所述的核酸适配体在检测sea中的应用。
19、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：本专利技术通过生物信息学分析了适配体和sea的结合机制。同时在分子对接辅助下进行序列融合设计实验，可以清晰地获得与靶标结合相关的适配体核心序列，提高工作效率和节约成本，最终获得了亲和力约是初始适配体1.79倍的高亲和力适配体，并成功应用于sea的检测。本专利技术不仅获得了针对sea的最佳适配体，为其实际应用奠定了基础，也为适配体的优化提供了良好的参考。同时，本专利技术中使用的融合设计方法可能对不同目标的稳定、低成本和高亲和力适配体提供一种有效且通用的策略。
本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体，其特征在于，其寡核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，步骤(1)中，所述初始适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，步骤(2)中，构象分析采用DiscoveryStudio和LigPlot+v2.2工具。
5.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，步骤(4)中，修饰是指在步骤(3)获得的新的适配体的3’端修饰6-羧基荧光素基团。
6.如权利要求1所述的特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体在检测金黄色葡萄球菌肠毒素A中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素a的核酸适配体，其特征在于，其寡核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种如权利要求1所述的特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素a的核酸适配体的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，步骤(1)中，所述初始适配体的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
<...
【专利技术属性】
技术研发人员：党亚丽，葛淑静，高新昌，潘道东，史西志，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。