【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于数字pcr方法的人mgmt甲基化检测试剂。
技术介绍
1、mgmt基因位于10号染色体上，全长170kb，含5个外显子和4个内含子。其中，第1外显子为启动子区，该启动子区富含gc序列；其余4个外显子均为编码区，可以编码207个氨基酸的o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶。o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶主要分布于细胞质中，其主要通过不可逆地将烷化基团从o6-mg转移到mgmt蛋白145位的半胱氨酸残基上而保护细胞免受烷化剂的损伤，对受烷化剂损伤的dna起修复的作用，来维持细胞中基因组的稳定性。在这一过程中，mgmt既作为甲基转移酶，又作为甲基受体蛋白，单独完成转移反应。
2、近几十年来，dna甲基化一直是深入研究的主题。mgmt基因启动子甲基化状态与mgmt蛋白的表达水平关系密切，启动子甲基化是mgmt基因最常出现的异常，多发生于mgmt基因启动子cpg岛，mgmt启动子甲基化后会导致染色质结构改变，阻止转录因子结合，导致基因的沉默，mgmt蛋白表达减少，从而失去了对dna的修复功能。mgmt基因启动子甲基化已成为评判脑胶质瘤患者预后的一个重要指标，也是对烷化剂化疗药物治疗响应良好的一个指标。
3、目前检测mgmt基因启动子甲基化的检测方法包括：
4、1、甲基化特异性pcr（ms-pcr），模板经重亚硫酸盐转化后，模板中甲基化的胞嘧啶保持不变，未甲基化的胞嘧啶则转化为尿嘧啶，通过转化后甲基化的模版和未甲基化的模板序列差异设计两组不同的引物进行pcr
5、2、荧光定量法（methylight），模板经重亚硫酸盐转化后，设计特异性的引物和taqman荧光探针进行扩增，最后根据荧光信号强度进行核酸定量分析。但此方法需要制备荧光标准曲线且可能存在假阳。
6、3、限制性酶切法（re-pcr），首先用甲基化敏感性限制性内切酶处理待测模板，然用选取甲基化位点两侧的dna序列设计引物进行pcr扩增。此方法虽费用低廉操作简单，但仅能反映限制性内切酶识别位点处cpg岛的甲基化状态；并且可利用的限制性内切酶数量较少，因此只能反应部分位点的甲基化状态；此外，该方法容易出现酶切不完全而导致假阳性，影响结果的准确度。
7、4、重亚硫酸盐测序法（bisulfite sequencing），此方法为检测“金标准”，通过将经重亚硫酸盐转化的模板依次经过pcr扩增、纯化、克隆、测序等步骤，建立基因组dna分子单个dna链的精确甲基化图谱，可以明确每个cpg位点的甲基化状态。但整个检测过程耗时较长且操作繁琐，检测成本也较高。
8、5、甲基化敏感性高分辨率熔解法（ms-hrm），模板经重亚硫酸盐转化后，设计一组不针对cpg位点的引物进行扩增，由于pcr扩增产物中胞嘧啶和鸟嘌呤的含量不同导致熔解曲线tm值变化，根据tm值的变化可检测出样本的甲基化情况。但此方法只能检测基因组整体的甲基化水平，不能检测特定位点的dna甲基化情况。
9、因此，亟需开发基于新方法的人mgmt甲基化检测试剂盒，以克服现有技术中存在的问题。
技术实现思路
1、数字pcr技术被行业内称为“第三代”pcr技术，不同于qpcr，数字pcr技术是将稀释后的反应体系分散到多个分隔开的微小独立反应单元（微滴）中，每个微滴包含或不包含靶标分子。经过pcr扩增完成后，对所有的微滴进行荧光信号识别并计数，以此计算阴性和阳性微滴的数量，通过泊松分布原理计算靶标分子的浓度，从而实现靶标分子的绝对定量。数字pcr的结果判定不依赖标准曲线，不受pcr扩增效率影响。此外，数字pcr检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，检测灵敏度和准确性进一步提高。
2、本专利技术中，主要使用迈克生物生产的d 600系列数字pcr分析系统，该数字pcr分析系统是利用振动式微滴生成技术实现微滴的生成并平铺到反应孔内，通过对扩增完成后的反应孔进行整体拍照、对每个微滴进行荧光有/无的判读、计数有荧光的微滴数和无荧光的微滴数，从而实现目标样本的定量检测。
3、由于本专利技术的数字pcr分析系统需要对反应孔进行整体拍照，如果微滴中荧光信号强弱的阈值划分不清楚，则会导致阴阳性微滴的判读错误，影响检测结果准确性。因此需要区分反应单元中靶标（阳性微滴）的荧光信号与其他背景信号或非特异性信号（阴性微滴），本专利技术已经具备。
4、此外，引物扩增效率和引物探针的特异性均会影响检测试剂的性能。例如反应单元之间的扩增效率不均一或者引物探针的特异性相对较差时，会产生荧光信号串扰或检测信号聚集度不够，从而影响检测结果的准确性。
5、基于此，本专利技术的目的之一在于，提供一种基于数字pcr的人mgmt甲基化检测试剂，该试剂包括mgmt引物探针组合物和actb引物探针组合物；
6、所述mgmt引物探针组合物包括：
7、mgmt上游引物f1，序列如seq id no.1所示；
8、mgmt下游引物r1，序列如seq id no.2所示；
9、mgmt探针p1，序列如seq id no.3所示；
10、所述actb引物探针组合物包括：
11、actb上游引物f，序列如seq id no.4所示；
12、actb下游引物r，序列如seq id no.5所示；
13、actb探针p，序列如seq id no.6所示；
14、所述mgmt探针p1和actb探针p分别标记有不同的检测基团。
15、在一个实施方式中，所述mgmt引物探针组合物还包括：
16、mgmt上游引物f2，序列如seq id no.7所示；
17、mgmt下游引物r2，序列如seq id no.8所示；
18、在另一个实施方式中，所述检测基团选自alex-350、fam、vic、tet、calfluorgold540、joe、 hex、cal fluor orange 560、tamra、cal fluor red 590、rox、calfluor red 610、texas red、cal fluor red 635、quasar 670、cy3、cy5、cy5.5、quasar 705中的一种或多种。
19、在一个优选实施方式中，所述mgmt探针p1上标记有rox，所述actb探针p上标记有hex。
20、在另一个实施方式中，所述mgmt探针p1和actb探针p还分别标记有淬灭基团，所述淬灭基团选自dabcyl、bhq1、bhq2、eclipse、tamra中的一种或多种。
21、本专利技术的另一个目的在于，提供一种基于数字pcr的人mgmt甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括上述所示的试剂。
<本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于数字PCR的人MGMT甲基化检测试剂，其特征在于该试剂包括MGMT引物探针组合物和ACTB引物探针组合物；
2.根据权利要求1所述的人MGMT甲基化检测试剂，其特征在于所述MGMT引物探针组合物还包括：
3.根据权利要求1所述的人MGMT甲基化检测试剂，其特征在于所述检测基团选自ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL FluorGold540、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL FluorRed 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red 635、Quasar 670、Cy3、Cy5、Cy5.5、Quasar 705中的一种或多种；优选地，所述MGMT探针P1上标记有ROX，所述ACTB探针P上标记有HEX。
4.根据权利要求1所述的人MGMT甲基化检测试剂，其特征在于所述MGMT探针P1和ACTB探针P还分别标记有淬灭基团，所述淬灭基团选自DABCYL、BHQ1、BHQ2、ECLIPSE、TAMRA中的一种或多种。
<...【技术特征摘要】
1.一种基于数字pcr的人mgmt甲基化检测试剂，其特征在于该试剂包括mgmt引物探针组合物和actb引物探针组合物；
2.根据权利要求1所述的人mgmt甲基化检测试剂，其特征在于所述mgmt引物探针组合物还包括：
3.根据权利要求1所述的人mgmt甲基化检测试剂，其特征在于所述检测基团选自alex-350、fam、vic、tet、cal fluorgold540、joe、hex、cal fluor orange 560、tamra、cal fluorred 590、rox、cal fluor red 610、texas red、cal fluor red 635、quasar 670、cy3、cy5、cy5.5、quasar 705中的一种或多种；优选地，所述mgmt探针p1上标记有rox，所述actb探针p上标记有hex。
4.根据权利要求1所述的人mgmt甲基化检测试剂，其特征在于所述mgmt探针p1和actb探针p还分别标记有淬灭基团，所述淬灭基团选自dabcyl、...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏丹，何辉煌，来茜，谢丽娜，刘盼，张谷，
申请(专利权)人：浙江省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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