【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及赤霉素发酵，尤其涉及一种赤霉素发酵工艺。
技术介绍
1、赤霉素作为植物五大激素之一，在生物体内起着内源性生长调节剂的作用，主要生理功能有：打破休眠，促进块茎、块根、种子发芽；促进植物细胞分裂，使其茎干延长；加速植物生长发育使农作物提前成熟、提高产量与品质；性别分化，诱导开花，提高坐果率；延长贮存期，减缓果实衰老；增强抗性，等。因此，赤霉素被广泛应用于小麦、棉花、水稻、蚕豆、花生、葡萄等栽培与农林业、酿造业生产，在粮食生产与林木杆插扩繁等领域创造了很大的经济效益与社会效益。赤霉素还具有处理技术简单、见效快、用量少、效益高、对环境和产品安全等特点，所以得到了非常广泛的应用。
2、虽然多数植物与细菌均能合成赤霉素，但是产量极低，目前赤霉素的工业化大规模生产主要通过微生物发酵法，常用菌种为丝状真菌藤仓赤霉菌。目前国内外产量差距较大，国内ga3与ga4的工业化发酵效价分别为1200-2000mg/l与600-800mg/l，而国外液态深层发酵赤霉素效价可达3900mg/l。目前国内应用较多的赤霉素为ga3，但ga4因其特有的优势在国内外市场的需求不断扩大，ga3因为活性太高，在打破植物休眠时会促进胚轴的过度生长，降低植株的抗倒伏性，同时还会促进表皮细胞的迅速生长，致使表皮角质层较薄，果实容易长斑破裂，而ga4能促进花芽分化，但不会使其过度生长。ga4还可打破休眠且不会引发胚轴的过度生长、开花效果良好、座果率高、能提高水果表皮角质层的韧性、预防褐斑病等等，因此对ga4发酵产量提高的探索十分必要。
3、因
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是提供一种提高ga4发酵产量的赤霉素发酵工艺。
2、植物油作为一种迟效碳源，可通过为菌种的生长发育提供能量以及缓解碳代谢抑制，从而提高藤仓赤霉菌合成赤霉素的能力。植物油经脂肪酶的分解作用，形成脂肪酸和甘油，在氧气充足的条件下脂肪酸通过β-氧化变成乙酰辅酶a，同时也为赤霉素合成提供更多的前体物。此外，不饱和脂肪酸可能具有对微生物生理有益的一些特性，因此比饱和脂肪酸更有利于发酵产物的积累。20世纪80年代末有研究小组就植物油对赤霉素发酵的影响进行了研究，结果发现葵花籽油的添加有利于赤霉素的合成，且在以芝麻油、豆油或橄榄油为主要碳源的培养基中，赤霉酸的效价显著高于以葡萄糖为主要碳源的培养基。一定浓度的芝麻酚会抑制镰刀菌生物量，但促进脂质积累，结果赤霉素的产量增加了20倍。这表明芝麻酚能够将乙酰辅酶a定向到次级代谢产物赤霉素的合成途径。研究发现在基础蛋白胨培养基中添加硬脂酸、棕榈酸和油酸等底物可刺激脂解活性，赤霉素产量增加了170％，并且活细胞数比在不添加底物的基础蛋白胨培养基中培养时增加了三倍。在抗生素的生产中，植物油也能用来提高产物效价，在以豆油为部分碳源进行发酵，有利于提高头霉素c的产量。也有相关研究表明复合植物油比单一植物油促进作用更佳，例如在红霉素发酵过程中添加多种植物油，可有效增加红霉素产量。由于油难溶于发酵体系，若浓度过高会影响发酵供氧速率，导致菌体前期生长缓慢，继而使得产物效价下降。因此选择合适的补油时间和补油浓度非常关键。
3、氮源的种类、质量和用量对赤霉素发酵起着重要的作用，通常稳定高产赤霉素的发酵条件都是低浓度的氮。因为赤霉素是一种典型的次级代谢物，不需要平衡的生长，需要的是氮限量的生长条件从而诱导高浓度的赤霉素产生。常用的无机氮源有硝酸钾、氯化铵、尿素等，有机氮源有玉米浆粉、玉米蛋白粉、豆粕粉、花生粉等，且不同种类的花生饼粉都能够有效提升ga3产量。在乳清培养基中添加含氮化合物时，赤霉素的含量降低，但生物量会急剧增加，从而推测额外添加的氮源可能让菌体生长过快，温度上升，溶氧量下降，从而造成赤霉素效价降低。以小麦蛋白为氮源，相比于脱脂豆粕ga3效价大大减少，但ga4产量却大幅提升。氮源种类可以影响酶活性，从而导致赤霉素种类和产量发生变化。同样的额外添加氮源，在低浓度氮源的培养基中添加少量各类植物粉末能促进赤霉素合成，推测这些植物粉末中可能含有赤霉素合成的前体物或促进剂。低浓度氮源通常能起促进作用，但研究发现硝酸根离子、铵根离子、谷氨酰胺、尿素和氨基酸这些氮源，无论是在发酵开始时就存在，或者中途添加都会抑制赤霉素的合成。
4、本专利技术提供的赤霉素发酵工艺包括以下步骤：步骤一：菌种活化：从-80℃低温冰箱中取出冷冻管保存菌种，菌种为藤仓赤霉菌，菌种转接到pda培养基上，28℃恒温培养7-8d得到活化种子液；
5、步骤二：液体种子培养：用无菌打孔器在经活化的pda培养基平板同一圆周上打取直径为10mm的菌饼，将菌饼放入装有无菌水与玻璃珠的试管中放入漩涡震荡仪中振荡10min得到菌悬液，每个菌饼搭配5ml无菌水；向摇瓶中加入菌悬液和种子培养基，种子培养基与菌悬液的体积百分比为：96％：4％，将摇瓶放入恒温振荡器中，在33℃、220rpm的条件下恒温振荡培养48h得到液体种子；
6、步骤三：ga4发酵：将液体种子接种到棕榈油发酵培养基上，棕榈油发酵培养基与液体种子体积百分比为：96％：4％，将接种后的培养基放入恒温振荡器中，在33℃、220rpm的条件下恒温振荡培养；设置两个对照组，第一对照组为：将液体种子接种到无油发酵培养基上，无油发酵培养基与液体种子体积百分比为：96％：4％，将接种后的培养基放入恒温振荡器中，在33℃、220rpm的条件下恒温振荡培养；第二对照组为：将液体种子接种到尿素发酵培养基上，尿素发酵培养基与液体种子体积百分比为：96％：4％，将接种后的培养基放入恒温振荡器中，在33℃、220rpm的条件下恒温振荡培养；当培养48h、144h、216h三个时间段时，分别测定各培养基的ga4效价和菌体生物量。
7、优选的，步骤一中pda培养基的原料配比为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15-20g/l,自然ph。
8、优选的，步骤二中的种子培养基的原料配比为：蔗糖30g/l，黄豆粕粉12g/l，nh4cl3g/l，nano3 3g/l，kh2po4 1.5g/l，k2so4 0.2g/l，μgso4·7h2o 0.2g/l，ph 6.8。
9、优选的，步骤三中的棕榈油发酵培养基的原料配比为：乳糖140g/l，黄豆粕粉10g/l，玉米浆粉10g/l，玉米蛋白粉5g/l，k2so4 2g/l，μgso4·7h2o 1g/l，znso4·7h2o0.005g/l，cocl2·6h2o 0.005g/l，尿素1.25g/l，棕榈油2.5g/l，ph 7.0。
10、优选的，步骤三中的无油发酵培养基的原料配比为：乳糖140g/l，黄豆粕粉10g/l，玉米浆粉10g/l，玉米蛋白粉5g/l，k2so4 2g/l，μgso4·7h2o1g/l，znso4·7h2o 0.005g/l，cocl2·6h2o 0.005g/l，尿素1.25g/l，ph7.0。
11、优选的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种赤霉素发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤一中PDA培养基的原料配比为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15-20g/L,自然pH。
3.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤二中的种子培养基的原料配比为：蔗糖30g/L，黄豆粕粉12g/L，NH4Cl 3g/L，NaNO33g/L，KH2PO4 1.5g/L，K2SO4 0.2g/L，ΜgSO4·7H2O 0.2g/L，pH 6.8。
4.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤三中的棕榈油发酵培养基的原料配比为：乳糖140g/L，黄豆粕粉10g/L，玉米浆粉10g/L，玉米蛋白粉5g/L，K2SO4 2g/L，ΜgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O0.005g/L，CoCl2·6H2O 0.005g/L，尿素1.25g/L，棕榈油2.5g/L，pH 7.0。
5.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤三中的无油发酵培养基的原料配比为：乳糖140g/L
6.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤三中的尿素发酵培养基的原料配比为：乳糖140g/L，黄豆粕粉10g/L，玉米浆粉10g/L，玉米蛋白粉5g/L，K2SO4 2g/L，ΜgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O0.005g/L，CoCl2·6H2O 0.005g/L，尿素5g/L，棕榈油2.5g/L，pH 7.0。
...【技术特征摘要】
1.一种赤霉素发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤一中pda培养基的原料配比为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15-20g/l,自然ph。
3.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤二中的种子培养基的原料配比为：蔗糖30g/l，黄豆粕粉12g/l，nh4cl 3g/l，nano33g/l，kh2po4 1.5g/l，k2so4 0.2g/l，μgso4·7h2o 0.2g/l，ph 6.8。
4.根据权利要求1所述的赤霉素发酵工艺，其特征在于，步骤三中的棕榈油发酵培养基的原料配比为：乳糖140g/l，黄豆粕粉10g/l，玉米浆粉10g/l，玉米蛋白粉5g/l，k2so4 2g/l，μgso4·7h2o 1g/l，znso4·7h2o0.005g/l，cocl2·...
【专利技术属性】
技术研发人员：林海萍，王丹，沈波，袁静，陆春锋，张心齐，俞海燕，陈杰，吴烨飞，殷凯楠，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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