【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，进一步属于植物病毒检测，具体涉及一种疑似感染cyrsv的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法。
技术介绍
1、辣椒黄化环斑病毒（chilli yellow ringspot virus, cyrsv）是布尼亚病毒目（buryavirales）番茄斑萎病毒科（tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（othotosporivius）的成员，属于西瓜银斑驳病毒（watermelon silver mottle orthotospovirus,wsmov）进化枝，能引起辣椒、番茄果实黄化环斑。cyrsv具有与其他othotosporivius病毒相似的粒体形态和基因组结构，是由球形包膜和大（l）、中（m）、小（s）单链rna分子片段组成的直径约80-120 nm的球状病毒，其中l-rna长度有8917 nt，属于负义rna，其互补链编码rna依赖的rna聚合酶（rdrp），该酶负责复制和转录病毒基因组；m-rna是双义rna，长度为4781nt，其病毒链编码非结构运动蛋白（nsm），其互补链编码两种结构糖蛋白（gn/gc），能修饰病毒粒子表面；s-rna也属于双义rna，长度有3428nt，病毒链主要编码其他非结构蛋白（nss），其互补链编码核衣壳蛋白。在自然界中，cyrsv在植物之间的传播主要是由媒介昆虫（如蓟马）通过持久的繁殖方式进行传播。
2、cyrsv是2020年在云南首次被发现并鉴定命名。近年来在云南番茄上发生普遍，为害多种番茄品种。与其同属的番茄斑萎病毒（tomato spotted
3、目前植物病毒检测的技术有很多，如血清学elisa检测技术、电子显微镜技术、pcr等分子生物学技术。随着检测要求和标准的不断提高，目前的常规检测技术越来越难以满足研究要求，如传统的elisa检测技术，加上抗体包被、孵育等步骤，通常需要1-2天。且这种血清学elisa需要有特异性病毒蛋白抗体才能检测，而往往抗体制备费用是昂贵的。电子显微镜-负染技术从样本到结果虽然只需要0.5-1个小时，但只能观察到病毒形态，很难判断病毒种属，并且透射电子显微镜设备昂贵。传统的pcr检测技术从样本到检测结果一般需要7-8个小时，运用病毒特异性引物可以鉴定病毒种类，但由于其灵敏度不高，对于病毒含量很低的样本很容易检测不到而出现假阴性。而实时荧光定量pcr（real time-quantitativepcr, rt-qpcr）技术是一种较常规pcr技术灵敏度更高，样本使用量更低，检测病毒更特异的定量工具，该方法从样本提取到结果分析仅需要5-6个小时，检测成本低，检测样本通量大，且获得的定量数据具有高度可重复性，准确度高。rt-qpcr技术分为相对定量和绝对定量，相对定量是通过检测样本中目的基因和内参基因的量，再通过固定公式分析目的基因的相对表达量。而绝对定量是通过构建目的基因的标准品，计算标准品的拷贝数，构建标准曲线，再样本中的待检测目的基因进行基因拷贝数的定量。绝对定量不仅能对基因进行定性，更主要是对基因进行定量，这更符合对样本中病毒含量的测定。更此技术已广泛应用于基因的功能表达与调控研究，以及定量特定核酸在不同寄主或病原体中的相对含量或绝对拷贝数，该技术在植物组织的病毒检测中已显示出绝对的优势。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种疑似感染cyrsv的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法。
2、本专利技术的目的是这样实现的，包括特异性检测和定量检测步骤，具体包括：
3、a、特异性检测：
4、1）设计辣椒黄化环斑病毒的n基因特异性专化引物cyrsv-n-f/cyrsv-n-r，扩增片段大小为828bp；
5、所述的cyrsv-n-f/cyrsv-n-r引物序列为：
6、cyrsv-n-f:5’-tcacacttccagagaagaacttggt-3’,
7、cyrsv-n-r:5’-atgtctaacgttaagcaactt-3’；
8、2）以确定感染cyrsv的植物为阳性样品，提取总rna，反转录成阳性样品cdna；
9、3）以该cdna为模板，以n基因特异性专化引物cyrsv-n-f/cyrsv-n-r扩增cyrsv n基因特异性片段，通过琼脂糖凝胶检测pcr产物；若扩增产物目的条带为828bp，则待测样品中携带cyrsv；若828bp位置没有目的条带，则待测样品中未携带cyrsv；
10、b、定量检测：
11、1）cyrsv病毒质粒标准品的制备：
12、以确定感染cyrsv的植物为阳性样品，提取总rna，反转录成阳性样品cdna，以该cdna为模板，以设计的cyrsv特异性引物cyrsv-qn-f/cyrsv-qn-r扩增cyrsv n基因特异性片段，通过琼脂糖凝胶检测并回收特异性条带，克隆到常规的t克隆载体（pmd18-t）上并测序验证正确获得质粒标准品；
13、所述的cyrsv-qn-f/cyrsv-qn-r引物序列为：
14、cyrsv-qn-f:5’-gcggtactgcagatgttgaa-3’
15、cyrsv-qn-r:5’-ggtccaatcttctggtccaa-3’；
16、2）cyrsv标准曲线的建立：
17、梯度稀释质粒标准品，以cyrsv-qn-f/cyrsv-qn-r为荧光定量引物，对不同浓度的质粒标准品进行荧光定量pcr，得出各浓度质粒标准品的ct值；以各浓度质粒标准品对应的病毒拷贝数的对数值为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线；
18、所述的cyrsv-qn-f/cyrsv-qn-r荧光定量引物序列为：
19、cyrsv-qn-f:5’-gcggtactgcagatgttgaa-3’
20、cyrsv-qn-r:5’-ggtccaatcttctggtccaa-3’；
21、3）待测植物样品中cyrsv的绝对定量：
22、提取待测植物样品的总rna，反转录成待测样品cdna；以该cdna为模板，cyrsv-qn-f/cyrsv-qn-r引物进行荧光定量pcr，得到待测植物样品的ct值；
23、以标准品ct值为横坐标，对应的拷贝数为纵坐标，建立cyrsv标准曲线，将待测样品ct值带入到上述cyrsv标准曲线中，计算出待测样品中cyrsv的拷贝数。
24、具体操作如下：
25、（1）植物样品中cyrsv的特异性鉴定检测：
26、cyrsv的n基因为辣椒黄化环斑病毒的核衣壳蛋白编码基因，n基因的扩本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对疑似感染CYRSV的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，包括特异性检测和定量检测步骤，具体包括：
2.根据权利要求1所述的对疑似感染CYRSV的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，A步骤2）和B步骤1）中反转录体系及反应条件为：Random 6 mersprimer (50 μM) 1 μL, dNTP mix 1 μL, 总RNA (2 μg) 4 μL，ddH2O 4 μL，总体积10 μL，65度5 min，4度保存进行下一步；上述反应液10 μL，5x RT Buffer 4 μL，Rnase inhibitor0.5 μL，Evo Rtase 1 μL, ddH2O 4.5 μL，总体积20 μL，30度10 min，42度30 min，95度5min，4度保存待用。
3.根据权利要求1所述的对疑似感染CYRSV的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，A步骤3）中扩增的反应体系为：cDNA模板（稀释10倍）2μL，2x TaqMix 12.5 μL，10μM上下游引物各1μL，d
4.根据权利要求1所述的对疑似感染CYRSV的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，A步骤3）中扩增的反应条件为：4度预变性30 s，98度变性10s，54度退火30s，72度延伸1min，35个循环，最后72度延伸2min。
5.根据权利要求1所述的对疑似感染CYRSV的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，B步骤中荧光定量PCR体系为：cDNA模板（稀释5倍）1μL，2x Taq mixSYBR Green 5 μL，10μM上下游引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL，总体积10 μL。
6.根据权利要求1所述的对疑似感染CYRSV的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，B步骤中荧光定量PCR反应条件为：95度预变性30 s，95度变性50 s，60度退火30 s，40个循环，增加溶解曲线。
...【技术特征摘要】
1.一种对疑似感染cyrsv的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，包括特异性检测和定量检测步骤，具体包括：
2.根据权利要求1所述的对疑似感染cyrsv的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，a步骤2）和b步骤1）中反转录体系及反应条件为：random 6 mersprimer (50 μm) 1 μl, dntp mix 1 μl, 总rna (2 μg) 4 μl，ddh2o 4 μl，总体积10 μl，65度5 min，4度保存进行下一步；上述反应液10 μl，5x rt buffer 4 μl，rnase inhibitor0.5 μl，evo rtase 1 μl, ddh2o 4.5 μl，总体积20 μl，30度10 min，42度30 min，95度5min，4度保存待用。
3.根据权利要求1所述的对疑似感染cyrsv的待测植物样品进行特异性检测及绝对定量的方法，其特征在于，a步骤3）中扩增的反应体系为：cdna模板（稀释10倍...
【专利技术属性】
技术研发人员：李妤，张仲凯，张洁，吴阔，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：
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